RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Determinanti genetici e molecolari del ruolo della COX-2 nell'aterotrombosi.

Università di riferimento

Università degli Studi "G. d'Annunzio" CHIETI-PESCARA - MEDICINA E SCIENZE DELL' INVECCHIAMENTO - CHIETI(CH)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Franco CUCCURULLO

Descrizione

OBIETTIVO Valutare nell'uomo se la sovraespressione del FACL4 guida la composizione della placca ateromatosa verso un fenotipo più stabile mediante l'inibizione dell'espressione ed attività delle MMP, enzimi di digestione dei componenti chiave strutturali della matrice extracellulare arteriosa. DISEGNO DELLO STUDIO 1)Sommario del disegno dello studio. Questo sarà uno studio osservazionale, a singolo centro, che valuterà e confronterà gli effetti dell'espressione del FACL4 nelle placche aterosclerotiche sui vari parametri esaminati. Nello studio saranno arruolati 60 pazienti in totale. 2)Procedure di studio. a) Reclutamento Entrerà nello studio un gruppo di 60 (maschi e femmine) pazienti, di cui 30 "sintomatici"e 30 "asintomatici" secondo la classificazione "North American Symptomatic Carotid Endarterectomy Trial" (NASCET) in attesa di essere sottoposti ad endoarterectomia per stenosi extracraniali di elevato grado (70%) dell'arteria carotidea interna (ICA). Il grado di occlusione vasale sarà determinato da ecografie Doppler e angiografie cerebrali intra-arteriose utilizzando i criteri del NASCET. Il gruppo dei pazienti sintomatici comprenderà soggetti che presentano i sintomi clinici dell'attacco ischemico cerebrale. I sintomi correlati alle lesioni carotidee includeranno la perdita della vista ad un occhio persistente o transitoria, attacchi ischemici transitori emisferici ed ictus ischemico. Gli ictus ischemici saranno definiti ictus aterotrombotici chiaramente correlati all'ulcerazione della lesione considerata dell'arteria carotide interna; i pazienti con altri tipi di ictus ischemici, come l'ictus lacunare, l'ictus cardioembolico, l'ictus combinato, l'ictus indifferenziato, e gli ictus correlati a vasculopatie non aterosclerotiche, saranno esclusi dallo studio. In particolare, gli ictus selezionati dovranno interessare sempre il territorio dell'arteria cerebrale media, come documentato dalla TC e dall'angiografia; su tutti i pazienti verranno eseguiti un esame Doppler per documentare la presenza di una lesione ulcerata nella carotide interna, e un'analisi Doppler preprocedurale transcraniale del flusso cerebrale ematico fortemente indicativa di un processo tromboembolico attivo. La presenza di ictus non aterotrombotici verrà esclusa in questi pazienti da esami clinici ed analisi di laboratorio e di immagine . Il secondo gruppo comprenderà 30 pazienti con una stenosi carotidea asintomatica, che sarà rilevata sulla base di un esame clinico sistematico di pazienti con malattia coronarica e periferica. I pazienti asintomatici non dovranno presentare episodi ischemici nel territorio della stenosi carotidea, né segni di ischemia alla TC cranio, ma verranno sottoposti ad endoarterectomia carotidea poiché questa procedura si è dimostrata efficace anche in questi pazienti (Asymptomatic Carotid Atherosclerosis Study, ACAS). La percentuale di riduzione del diametro carotideo (70-93%), i metodi procedurali, la terapia concomitante, e i fattori di rischio non dovranno differire nei due gruppi. b) Protocolli • Protocollo A Questo studio comprenderà 60 pazienti consecutivi ricoverati per trattamento chirurgico sotto terapia cronica a base di aspirina (100 mg/die), in attesa di essere sottoposti ad endoarterectomia carotidea per stenosi extracraniale di elevato grado dell'arteria carotidea interna (stenosi 70%). Il reclutamento sarà terminato quando saranno ottenuti due gruppi predeterminati uguali di 30 pazienti in base all'evidenza clinica di stabilità di placca, come su descritto. I parametri investigati saranno: 1) La concentrazione nel siero della proteina C reattiva (PCR) e del ligando solubile del CD40 (sCD40L), e la concentrazione nel plasma di interleuchina (IL)-6 e MCP-1 come indici sistemici di infiammazione. 2) Accumulo nella placca di macrofagi CD68+, linfociti T CD3+, cellule HLA-DR+ e cellule muscolari lisce -actina+ come indici in situ di processi infiammatori attivi. 3) Espressione nella placca del FACL4 quale enzima coinvolto nella modulazione del metabolismo dell'arachidonato. 4) Espressione nella placca di COX-1, COX-2, cPGES, mPGES-1 come indici del metabolismo pro- infiammatorio dell'acido arachidonico. 5) Determinazione del livello nella placca dell'estere dell'arachidonoil CoA, come indice dell'attività enzimatica del FACL4 nella placca. 6) Espressione ed attività nella placca di MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-9 e TIMP-1 come indici di attività proteolitica. 7) Espressione ed attività nella placca del Fattore tissutale (TF) e dell'inibitore dell'attivatore del plasminogeno (PAI)-1 come indici del carico protrombotico. I sovraindicati indici sierici e plasmatici saranno eseguiti in tutti i pazienti prima dell'endoarterectomia. I tests immunoistochimici sovramenzionati saranno eseguiti in tutti i pazienti sul campione derivante dall'endoarterectomia. •Protocollo B Al fine di determinare se la produzione di MMP PGE2-dipendente può essere modulata dalla via enzimatica del FACL4, compareremo il rilascio in vitro di PGE2 e di MMP in due esperimenti diversi che utilizzeranno: 1) cellule trasformate sovraesprimenti la COX-2, il FACL4 ed entrambi gli enzimi; 2) macrofagi estratti dalle placche aterosclerotiche di 10 pazienti. Nel primo esperimento, la linea cellulare EcR293 verrà trasfettata con costrutti di cDNA per formare linee cellulari stabili sovraesprimenti la COX-2, il FACL4 e COX-2/FACL4. Le cellule trasfettate e cellule di controllo verranno piastrate (8 x 100.000 cellule/pozzetto), trattate con AA 10 M ed incubate a 37°C per 30 minuti. Al termine del periodo di incubazione, i media saranno raccolti e verranno valutati: - il rilascio di PGE2 mediante tecnica ELISA - il rilascio e l'attività della MMP-2 e MMP-9 mediante tecnica ELISA e zimografia rispettivamente. Nel secondo esperimento, i macrofagi estratti dalle placche aterosclerotiche saranno messi in coltura ed incubati con: a) RPMI b) LPS (1 g/L) c) AA (10 M) d) AA (10 M) + triacsina C (inibitore selettivo del FACL4, 10 M)) e) AA (10 M)+ Aspirina (200 M) + NS-398 (inibitore selettivo della COX-2, 1 M) I parametri esaminati saranno: 1) Espressione macrofagica (mRNA e proteina) di FACL4, COX-2, mPGES-1, MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-9, TIMP-1 mediante RT-PCR e western blot. 2) Rilascio macrofagico di PGE2 mediante tecnica ELISA. 3) Rilascio macrofagico ed attività di MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-9, TIMP-1 rispettivamente mediante tecnica ELISA e zimografia. 4) Espressione ed attività macrofagica di TF come indice dell'attività protrombotica.