Bibliografia
1. Cosentino F, Luscher TF. Endothelial Dysfunction in Diabetes Mellitus.
Journal of Cardiovascular Pharmacology. 1998; 32 (3): 54-61.
2. Cosentino F, Hishikawa K, Katusic ZS, et al. High glucose increases nitric oxide synthase expression and superoxide anion generation in human aortic endothelial cells. Circulation. 1997; 96: 25-28.
3. Tesfamariam B. Free radicals in diabetic endothelial cell dysfunction Free Radic Biol Med . 1994; 16: 383-391.
4.Lee TS, Saltsman KA, Ohashi H, et al. Activation of protein kinase C by elevation of glucose concentration: proposal for a mechanism in the development of diabetic vascular complications. Proc Natl Acad Sci USA. 1989; 86: 5141-5145.
5. Inoguchi T, Battan R, Handler E, et al. Preferential elevation of protein kinase C isoform II and diacylglycerol levels in the aorta and heart of diabetic rats: differential reversibility to glycemic control by islet cell transplantation. Proc Natl Acad Sci USA. 1992; 89: 11059-11063.
6. Marsden PA, Heng HHQ, Scherer SW et al. Structure and chromosomal localization of the human constitutive endothelial nitric oxide synthase gene. J Biol Chem. 1993; 268: 17478-17488
7. Inoue H, Yokoyama C, Hara S, et al. Transcriptional regulation of human prostaglandin-endoperoxide synthase-2 gene by lipopolysaccharide and phorbol ester in vascular endothelial cells: involvement of both nuclear factor for interleukin-6 expression site and cAMP response element. J Biol Chem. 1995; 270: 24965-24971.
8. Subbaramaiah K, Chung WJ, Michaluart P, et al. Resveratrol inhibits cyclooxygenase-2 transcription and activity in phorbol-ester-treated human mammary epithelial cells. J Biol Chem. 1998; 273: 21875-21882.
9. Wu KK, Hatsakis H, Lo SS, et al. Stimulation of de novo synthesis of prostaglandin G/H synthase in human endothelial cells by phorbol esters. J Biol Chem. 1988; 263: 19043-19047.
10. Tesfamariam B, Brown ML, Cohen RA. Elevated glucose impairs endothelium-dependent relaxation by activating protein kinase C. J Clin Invest. 1991; 87: 1643-1648.
11. Williams CW, DuBois RN. Prostaglandin endoperoxide synthase: why two isoforms? Am J Physiol. 1996; 270: G395-G400.
12. Cosentino F, Eto M, De Paolis P, van der Loo B, Bachschmid M, Ullrich V, Kouroedov A, Delli Gatti C, Joch H, Volpe M, Lüscher TF. High concentration of glucose causes upregulation of cyclooxygenase-2 expression and function in human endothelial cells. Circulation 2003; 107: 1017-1023.
13. Hara S, Miyata A, Yokoyama C, et al. Isolation and molecular cloning of prostacyclin synthase from bovine endothelial cells. J Biol Chem. 1994; 269: 19897-19903.
14. Katusic ZS, and Vanhoutte PM. Superoxide anion is an endothelium
derived contracting factor. Am. J. Physiol. 1989; 257: H33-H37.
15. Zou M, Martin C, Ullrich V. Tyrosine nitration as a mechanism of selective inactivation of prostacyclin synthase by peroxynitrite. Biol Chem. 1997; 378: 707-713.
16. Tesfamariam B, Brown ML, Deykin D, et al. Elevated glucose promotes generation of endothelium-derived vasoconstrictor prostanoids in rabbit aorta. J Clin Invest. 1990; 85: 929-932.
17. Ting HH, Timimi FK, Boles KS, et al. Vitamin C improves endothelium
dependent vasodilation in patients with non-insulin-dependent diabete
mellitus. J Clin Invest. 1996; 97: 22-28.
18. Timimi FK, Ting HH, Haley EA, et al. Vitamin C improves endothelium-dependent vasodilation in patients with insulin-dependent diabetes mellitus. J Am Coll Cardiol. 1998; 31: 552-557.
19. Migliaccio E, Giorgio M, Mele S, Pelicci G, Reboldi P, Pandolfi PP, Lanfrancone L, Pelicci PG. The P66shc adaptor protein controls oxidative stress response and life span in mammals. Nature, 1999;402:309-313.
20. Soriano FG, Pacher P, Mabley J , Liaudet L, Szabo C. Rapid reversal of the diabetic endothelial dysfunction by pharmacological inhibition of poly(ADP-ribose) polymerase. Circ Res 2001; 89: 684-691.
Gli esperimenti verranno condotti tra topi knock-out p66Shc-/-e controlli wild-type di 12-16 settimane e sesso maschile. Tutte le procedure coinvolte nella sperimentazione saranno eseguite secondo le linee guida per la ricerca su modelli animali del nostro Dipartimento di Medicina Sperimentale e Patologia dell'Università "La Sapienza". Una singola dose di streptozotocina (STZ) sarà utilizzata per indurre la distruzione delle cellule beta pancreatiche e di conseguenza una condizione di iperglicemia cronica (20). Gli animali riceveranno una singola somministrazione intraperitoneale di STZ (200 mg/Kg) o buffer citrato (controlli). Peso corporeo, glicemia, livelli di insulina, pressione arteriosa e frequenza cardiaca saranno monitorati ogni settimana. L'iperglicemia verrà definita mediante la determinazione random di valori superiori ai 20 mmol/L per un periodo superiore alle 3 settimane. Dopo 4 settimane, i topi verranno anestetizzati con una somministrazione intraperitoneale di 50 mg/Kg di pentobarbital e poi sacrificati. Le aorte saranno isolate e congelate, fissate in paraffina o utilizzate immediatamente in accordo al protocollo dello studio. Diverse metodiche come la misurazione delle variazioni della tensione isometrica (reattività vascolare in vitro), analisi northern e western, microsensore porfirinico per la rilevazione di NO, sonde fluorescenti, tecniche di immunoistochimica e di labeling, determinazioni RIA verranno impiegate per rispondere ai seguenti quesiti: 1) La proteina p66Shc è coinvolta nello stress ossidativo indotto dal glucosio? 2) L'upregulation di COX-2, l'alterazione del profilo prostaglandinico e la conseguente disfunzione endoteliale viene influenzata dalla inattivazione della p66Shc? I nostri risultati preliminari indicano chiaramente che la resistenza allo stress ossidativo dei topi p66Shc-/- protegge i vasi nei confronti della disfunzione endoteliale associata all'invecchiamento e dipendente dall'aumentata produzione di ROS. Quindi, è verosimile che la condizione di diabete mellito di tipo I indotto dalla streptozotocina caratterizzata da un pronunciato stress ossidativo possa individuare un potenziale effetto protettivo di un approccio volto ad inattivare la proteina p66Shc. Poiche l'iperglicemia è stata riportata essere strettamente correlata con un'aumentata produzione di radicali liberi dell'ossigeno e conseguente nitrotirosilazione di proteine tissutali, saranno eseguiti su omogenati di aorta i seguenti esperimenti: - analisi western e immunostaining per la determinazione di proteine nitrotirosilate - immunoprecipitazione e western blotting per la determinazione della nitrosilazione della PGIS Inoltre la produzione di anione superossido sarà determinata mediante chemiluminescenza su aorte isolate. La formazione di ROS sarà anche valutata con la sonda fluorescente CM-H2DCFDA, metodo comunemente utilizzato per la determinazione di ONOO-. Poiche i pazienti diabetici e i modelli sperimentali di diabete mellito condividono una comune alterazione della funzione endoteliale, un ridotto rilascio di NO e un'aumentata produzione vascolare di ROS e prostanoidi vasocostrittori, nel nostro studio la funzione endoteliale sarà valutata in segmenti di aorta isolati da topi p66Shce wild-type diabetici e non diabetici mediante l'utilizzo di un set-up di organ chambers. Si determineranno in questo modo i rilasciamenti endotelio-dipendenti in risposta alla acetilcolina e ionoforo del calcio (rispettivamente agonista recettore-dipendente e recettore-indipendente) e i rilasciamenti endotelio-indipendenti al nitroprussiato di sodio. Per valutare gli effetti dei radicali liberi e degli scavengers sulla vasomotilità, esperimenti saranno condotti con xantina/xantina ossidasi in presenza o meno di SOD, catalasi e deferoxamina. Altri esperimenti saranno condotti in presenza di inibitori non selettivi della COX (indometacina), inibitori selettivi di nuova generazione della COX-2 o antagonisti dei recettori per PGH2/TXA2 (SQ29548) per valutare il relativo coinvolgimento di eicosanoidi vasocostrittori e vasodilatatori. A livello biochimico i pathways della COX e del NO saranno ulteriormente esplorati con: - RT-PCR e northern blotting per la espressione di COX-1, COX-2 mRNA - Analisi western per la espressione dei livelli proteici di COX-1, COX-2, eNOS e iNOS - Determinazione dei livelli tissutali di prostanoidi con metodica RIA - Misurazione in situ del rilascio massimale di NO con sensore porfirinico - Determinazione della attività di eNOS e iNOS mediante dosaggio della L-citrullina. Poiche una riduzione del potenziale dei sistemi antiossidanti è stata riconosciuta contribuire alla disfunzione endoteliale nel diabete, verrà determinata l'integrità di un importante sistema scavenger – superossido dismutasi (SOD) - espressione di MnSOD (analisi western) - attività di MnSOD - nitrosilazione di MnSOD (come indice della in attivazione di questo enzima indotto da stress ossidativo, mediante immunoprecipitazione e analisi western) Nonostante i recenti progressi della ricerca cardiovascolare abbiano migliorato le nostre conoscenze sul danno vascolare indotto dal glucosio, il nesso patogenetico tra concentrazione di glucosio e complicanze vascolari del diabete rimane ancora oggetto di intensa investigazione e dibattito. Il presente progetto di ricerca permetterà di caratterizzare ulteriormente i meccanismi molecolari che contribuiscono alla malattia vascolare diabetica. Inoltre l'osservazione di un'aumentata resistenza alla disfunzione endoteliale indotta da iperglicemia nei topi p66Shc-/- diabetici permetterebbe di considerare il blocco farmacologico della proteina p66Shc come un attraente approccio terapeutico per prevenire lo sviluppo e la progressione delle sue complicanze.
