RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Determinanti genetici e molecolari del ruolo della COX-2 nell'aterotrombosi.

Università di riferimento

Università degli Studi di MILANO - SCIENZE FARMACOLOGICHE - MILANO(MI)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Alberico Luigi CATAPANO

Descrizione

Progetto All’interno del progetto “Genetic and molecular determinants of the role of Cox-2 in atherotrombosis”, la nostra unità di ricerca avrà un ruolo centrale nello studiare gli effetti delle HDL sul segnale della Cox-2, focalizzandosi sui meccanismi molecolari coinvolti nella modulazione di Cox-2 da parte della HDL in vivo e in vitro. L’espressione della Cox-2 e delle chinasi coinvolte nella sua modulazione saranno indagate in cellule endoteliali umane e a livello dell’arco aortico di topi Apo A-I Knock out e di topi transgenici overesprimenti l’Apo A-I umana, usando real time RT quantitativa PCR, immunoblotting e immunofluorescenza. Gli effetti delle HDL native saranno inoltre confrontati con quelli delle HDL modificate chimicamente o enzimaticamente. Il presente progetto ha anche lo scopo di capire il ruolo delle differenti componenti delle HDL native e modificate, inclusa l’ Apo A-I, i lipidi polari e non polari, nella modulazione dell’induzione di Cox-2 e ciò verrà attuato con la generazione di HDL ricostituite che potrebbero selettivamente influenzare l’induzione di Cox-2 e la sintesi di prostaciclina; le proprietà di queste lipoproteine ricostituite saranno testate in vitro e in vivo. Gli effetti dei prostanoidi prodotti attraverso il meccanismo HDL/Cox-2 dipendente, saranno inoltre investigati in cellule endoteliali usando tecniche di cDNA array. Il recente sviluppo della tecnologia gene array, offre nuove opportunità per valutare contemporaneamente molti geni e l’analisi del patterns di espressione genica in HUVEC può condurre ad una migliore comprensione degli effetti delle HDL sull’endotelio. I nuovi geni che saranno modulati con meccanismo HDL/Cox-2 dipendente, saranno successivamente investigati usando real time RT quantitativa PCR, immunoblotting, immunofluorescenza e nei modelli animali precedentemente descritti. Il progetto sarà diviso in tre parti: 1. Investigazione dei meccanismi molecolari responsabili degli effetti delle HDL sull’espressione genica di Cox-2 in vitro ed in vivo (0-6 mesi). 2. Identificazione delle componenti (Apo A-I, lipidi polari e non polari) responsabili dell’induzione di Cox-2; generazione di particelle ricostituite contenenti queste componenti e valutazione della loro efficacia in vivo e in vitro (0-24 mesi). 3. Identificazione dei prostanoidi prodotti in cellule endoteliali via Cox-2, espressione ed attività indotta da HDL (12-24 mesi). 1: Precedenti studi effettuati dalla nostra unità di ricerca (1a) hanno identificato, in vitro, che p38 MAPK svolge un ruolo centrale nell’espressione di Cox-2 indotta da HDL, ed è però ancora ignoto se questo meccanismo è effettivo anche in vivo. Per risolvere quest’ultima questione studieremo l’espressione di Cox-2 sia a livello dell’mRNA si a livello proteico nell’arco aortico di topi Apo A-I Knock out e di topi transgenici overesprimenti l’Apo A-I umana usando real time RT quantitativa e immunoblotting. Inoltre mediante studi di immunofluorescenza valuteremo la presenza di chinasi fosforilate nella parete arteriosa di questi topi. La presenza della forma attiva di ERK 1/2, p38 MAPK e Akt sarà analizzata mediante microscopia convocale (Nikon Eclipse TE 2000-S, Radiance 2100 Biorad) con un ingrandimento di 600X. Attraverso uno specifico software (Laserpix) saranno inoltre svolti studi di colocalizzazione. Questi studi saranno utilizzati per identificare quali cellule della parete arteriosa di questi topi , esprimono principalmente la Cox-2 e dove l'enzima colocalizzi con le chinasi intracellulari attivate. E’ stato dimostrato che le HDL possono subire modificazione chimica ed enzimatica generando così Ox-HDL che possiedono proprietà pro aterogene. E’ stato dimostrato in vitro che le Ox-HDL possono attivare p38 MAPK, valuteremo quindi come questa attivazione porti a variazioni dell’espressione di Cox-2 e i meccanismi molecolari implicati. Le cellule saranno transfettate transientemente con i vettori luciferasi reporter contenenti il promotore della Cox-2 (nucleotide -327/+59) e nelle forme mutate per il sito di NF-kB (KMB) e per il sito di CREB (CRM), con il metodo della lipofectamina come descritto (1a). L’attività luciferasica sarà determinata e normalizzata per la concentrazione di proteine cellulari. Le HDL possono influenzare anche l’espressione di Cox-2 attraverso la stabilizzazione dell’mRNA via p38 MAPK e la fosforilazione della caveolina-1 (1a); sarà perciò valutato l’effetto delle Ox-HDL su questi meccanismi. 2: Le HDL sono costituite da apolipoproteine, soprattutto Apo A-I e Apo A-II e lipidi (polari e non polari). Queste particelle attivano differenti vie del segnale intracellulare nelle cellule endoteliali, portando quindi ad una differente espressione genica. La componente responsabile dell’induzione di Cox-2 è ancora ignota. In questa parte del progetto saranno investigati gli effetti delle differenti componenti delle HDL sull’attivazione delle differenti cascate chinasiche intracellulari e sull’espressione di Cox-2. Una volta identificata la/e componente/i responsabile di questo effetto, saranno generate HDL ricostituite contenenti questa componente è sarà studiata la loro efficacia in cellule endoteliali in vitro, ed in vivo, attraverso la loro infusione in topi Apo A-I-/- e studiando l’induzione della Cox-2 nella parete arteriosa (mRNA e proteina) e il rilascio di prostaglandine. 3: La terza parte del progetto avrà lo scopo di indagare gli effetti dei prostanoidi prodotti con meccanismo HDL/Cox-2 dipendente in cellule endoteliali attraverso un approccio di cDNA array. L’unità di ricerca ha già una lunga esperienza dello studio dell’espressione genica usando un approccio di micro e macro array (2a-4a). Il sovranatante condizionato di cellule endoteliali incubate in presenza di HDL con o senza inibitori della Cox-2 sarà innanzitutto utilizzato per caratterizzare le prostaglandine secrete, utilizzando un saggio immunoenzimartico competitivo. Le cellule saranno quindi successivamente incubate con questo sovranatante per identificare il differente patterns di espressione genica. I nuovi geni che saranno modulati in modo HDL/Cox-2 dipendente saranno investigati attraverso real time RT quantitativa immunoblotting e immunofluorescenza nei modelli animali precedentemente descritti. Infine l'espressione dei geni identintificati in vitro, verrà valutata in plachhe carotidee umane. Le placche isolate dopo intervento di endoarterectomia dall'Unità di Ricerca di Chieti, verranno conservate in RNA later ed inviate presso l'Unità di Ricerca di Milano che procederà allo studio dell'espressione genica. Sulle stesse placche l'Unita di Ricerca di Chieti effettuerà l'analisi morfologica e valuterà la presenza dei fattori di rischio cardiovascolare nei pazienti operati. Verrà effetuata un'analisi dei dati comune con lo scopo di associare i profili di espressione genica identificati con la morfologia della placca e i fattori di rischio cardiovascolari presenti. Metodi HDL3 (d 1.125-1.21 mg/ml) saranno isolate da plasma umano e il contenuto proteico sarà determinato come descritto (2a). Le HDL3 saranno utilizzate entro 6 ore dall’isolamento. La contaminazione con LPS sarà valutata mediante kit per endotossina (Sigma, Italia). Le HUVECs saranno isolate e coltivate come descritto (3a). In tutti gli esperimenti, le cellule saranno preincubate con medium serum-free per 6 ore (2a-4a) e saranno quindi aggiunte HDL3. Real time RT PCR. L’RNA totale sarà estratto e successivamente retrotrascritto come descritto (2a-4a). Tre µl di cDNA saranno amplificati attraverso real time quantitativa PCR con 1X Syber green universal PCR mastermix (Biorad). La specificità della fluorescenza del Syber green sarà testata plottanto la fluorescenza in funzione della temperature per generare una curva di melting dell’amplicone. Transfezioni.La costruzione di differenti vettori reporter per il gene della Cox-2 umana sono stati precedentemente descritti (1a). Nella nostra esperienza, esperimenti di transfezioni effettuati su HUVECs e EAhy 926 hanno dato una bassissima efficienza con un elevato grado di tossicità. Poiché la regolazione del promotore della Cox-2 è molto simile in un ampio numero di tipi cellulari (5a-7a), gli esperimenti di transfezione saranno effettuati nelle CHO, una linea cellulare ampiamente utilizzata negli studi riguardanti gli effetti delle HDL in vitro (8a,9a). Le CHO saranno transfettate transientemente con i vettori luciferasi reporter contenenti il promotore della Cox-2 e nelle forme mutate per il sito di NF-kB (KMB) o per il sito di CREB (CRM), con il metodo della lipofectamina (Invitrogen, Italia). L’attività luciferasica sarà determinata e normalizzata per la concentrazione di proteina cellulare (1a). Rilevazione delle prostaglandine rilasciate attraverso saggio competitivo immunoenzimatico. Verrà effettuato un saggio competitivo immunoenzimatico per la 6-chetoPGF1α, il TXB2 e la PGE2 (Cayman, USA). Le HUVECs saranno incubate con HDL3 per 6 ore, lavate due volte con PBS e quindi incubate con AA (10µM) esogeno per 30 minuti. 50µl di ciascun campione saranno analizzati per il rilascio di prostaglandina. Studi animali. La generazione di topi transgenici over esprimenti l’Apo A-I umana (hA-I) e mancanti dell’Apo A-I è stata precedentemente descritta (10a). Sette topi hA-I e sette topi knock out per l’Apo A-I (Apo A-I-/-) (tre maschi e quattro femmine per ciascun gruppo ) sono stati nutriti con una dieta standard per 18 settimane. I topi sono stati sacrificati con diossido di carbonio in accordo con la commissione etica. Al sacrificio, i livelli di HDL erano di 11.9 ±4.9 mg/dL per i topi Apo A-I -/- e di 124.2 ± 31.1 mg/dL per i topi trangenici hA-I (10a). Dopo perfusione con soluzione fisiologica (0.9% cloruro di sodio), le aorte sono state prelevate e riposte in RNA later (Ambion, Germania) a -20 °C o incluse in paraffina. Per l’isolamento dell’RNA i campioni saranno stati omogeneizzati attraverso un dismembranetor (B.Braun, Melsugen AG, Germania) quindi trattati come precedentemente descritto e conservati per il seguente studio. Per l’analisi di immunofluorescenza, campioni di aorta sezionate (spessore di 5 µm) (11a) saranno incubate con un anticorpo primario (1:50) overnight a 4°C, seguita da incubazione con anti rabbit IgG Alexa 633-coniugato (1:100, Molecular Probes) per 30 minuti e quindi sarà aggiunto propidio ioduro (2.5 µg/mL) per 30 minuti. I campioni saranno analizzati con microscopia confocale come descritto (1a). L’analisi di colocalizzazione sarà effettuato usando un software Laserpix (Bio-Rad). Analisi Statistica. Un’analisi statistica sarà effettuata mediante ANOVA con l’utilizzo del software Statsoft Statistica. 1a. Norata GD, Callegari E, Inoue H, Catapano AL.HDL3 Induces Cyclooxygenase-2 Expression and Prostacyclin Release in Human Endothelial Cells Via a p38 MAPK/CRE-Dependent Pathway: Effects on COX-2/PGI-Synthase Coupling. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2004 Mar 4 2a. Norata GD, Pellegatta F, Hamsten A, Catapano AL, Eriksson P. Effects of high density lipoprotein subfraction 3 on the expression of matrix-degrading proteases in human endothelial cells. Int J Mol Med 2003;12;73-78. 3a. Norata GD, Pirillo A, Callegari E, Hamsten A, Catapano AL, Eriksson P. Gene expression and intracellular pathways involved in endothelial dysfunction induced by VLDL and oxidised VLDL. Cardiovasc Res 2003;59:169-180. 4a. Norata GD, Bjork H, Hamsten A, Catapano AL, Eriksson P. High density lipoprotein decrease ADAMTs1 expression induced by LPS and TNFα in human endothelial cells. Matrix Biology 2004;22:557-60. 5a. Singer CA, Baker KJ, McCaffrey A, AuCoin DP, Dechert MA, Gerthoffer WT. P38 MAPK and NF-{kappa}B Mediate COX-2 Expression in Human Airway Myocytes. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2003;285:L1087-1098 6a. Loudon JA, Elliott CL, Hills F, Bennett PR. Progesterone represses interleukin-8 and cyclo-oxygenase-2 in human lower segment fibroblast cells and amnion epithelial cells. Biol Reprod. 2003;69:331-337. 7a. Tamura M, Sebastian S, Yang S, Gurates B, Fang Z, Okamura K, Bulun SE. Induction of cyclooxygenase-2 in human endometrial stromal cells by malignant endometrial epithelial cells: evidence for the involvement of extracellularly regulated kinases and CCAAT/enhancer binding proteins. J Mol Endocrinol. 2003;31:95-104. 8a. Baez JM, Barbour SE, Cohen DE. Phosphatidylcholine transfer protein promotes apolipoprotein A-I-mediated lipid efflux in Chinese hamster ovary cells. J Biol Chem. 2002;277:6198-6206. 9a. Ioka RX, Kang MJ, Kamiyama S, Kim DH, Magoori K, Kamataki A, Ito Y, Takei YA, Sasaki M, Suzuki T, Sasano H, Takahashi S, Sakai J, Fujino T, Yamamoto TT. Expression cloning and characterization of a novel glycosylphosphatidylinositol-anchored high density lipoprotein-binding protein, GPI-HBP1. J Biol Chem. 2003;278:7344-7349. 10a. Chiesa G, Parolini C, Canavesi M, Colombo N, Sirtori CR, Fumagalli R, Franceschini G, Bernini F.Human apolipoproteins A-I and A-II in cell cholesterol efflux: studies with transgenic mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 1998Sep;18(9):1417-23. 11a. Norata GD, Tonti L, Roma P, Catapano AL.Apoptosis and proliferation of endothelial cells in early atherosclerotic lesions: possible role of oxidised LDL. Nutr Metab Cardiovasc Dis. 2002 Oct;12(5):297-305.