RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Determinanti genetici e molecolari del ruolo della COX-2 nell'aterotrombosi.

Università di riferimento

Università di PISA - MEDICINA INTERNA - PISA(PI)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Armando MAGAGNA

Descrizione

Studi nell'uomo Pazienti. Saranno reclutati pazienti con un differente profilo di rischio cardiovascolare. In particolare, sarà studiato un gruppo di paziente con un basso profilo di rischio (0-1 fattore di rischio cardiovascolare), un gruppo di pazienti con un profilo di rischio medio (2-3 fattori di rischio cardiovascolare ed un gruppo finale di pazienti ad alto rischio (più di 3 fattori di rischio cardiovascolare o pazienti diabetici, o pazienti con un precedente evento cardiovascolare). La numerosità dei pazienti per singolo gruppo sarà decisa sulla base dei risultati preliminari. Comunque, è ragionevole ipotizzare che occorreranno circa 100-150 pazienti per gli studi sul microcircolo e circa 200-300 pazienti per gli studi sul macrocircolo. Modello sperimentale Studi sul microcircolo. Sarà utilizzata la tecnica dell'avambraccio isolato e perfuso, una metodica già in uso da molti anni nel nostro laboratorio. Attraverso la cannulazione dell'arteria brachiale, sarà possibile infondere direttamente in arteria brachiale agonisti ed antagonisti endoteliali. Dalla stessa cannula sarà possibile eseguire campionamenti di sangue arterioso. La risposta vascolare all'infusione dei farmaci sarà valutata misurando le modificazioni di flusso arterioso mediante pletismografia a strain-gauge. Disegno sperimentale. La vasodilatazione endotelio-dipendente sarà valutata mediante una curva dose-rispossta all'acetilcolina. La vasodilatazione endotelio-indipendente sarà valutata mediante una curva dose-risposta al nitroprussiato di sodio. Per valutare la biodisponibilità di NO, la curva dose-risposta all'acetilcolina sarà ripetuta in presenza di L-NMMA, un inibitore dell'NO sintetasi. La produzione di stress ossidativo sarà valutata ripetendo l'acetilcolina in presenza di infusione intrabrachiale di vitamina C, un antiossidante. I risultati di questo studio confermeranno la presenza di una progressiva riduzione della vasodilatazione endotelio-dipendente nei pazienti con un crescente numero di fattori di rischio cardiovascolare. Un ridotto o assente effetto inibitorio da parte della L-NMMA sulla vasodilatazione indotta dall'acetilcolina indicherà una ridotta biodisponibilità di NO. Un effetto potenziante della vitamina C sull'acetilcolina sarà assunta come marker di produzione di stress ossidativo. Se i pazienti portatori dell'allele -765C per il gene della COX-2 mostreranno una normale funzione endoteliale, un maggior effetto inibitorio della L-NMMA ed un ridotto effetto potenziante della vitamina C sull'acetilcolina, questi risultati confermeranno l'ipotesi che l'allele -765C esercita un ruolo protettivo nei confronti della disfunzione endoteliale mediata dallo stress ossidativo. Studio del macrocircolo. La Flow-mediated arterial dilation (FMD) rappresenta un metodo non invasivo per misurare la vasodilatazione endotelio (NO)-dipendente nell' uomo e può essere misurata utilizzando ultrasuoni ad alta risoluzione. Viene ottenuta una scansione longitudinale (B-mode) dell' arteria omerale da 5 a 10 cm sopra la piega del gomito, utilizzando un ecografo ad alta risoluzione con sonda lineare da 7.5 MHz. La sonda viene mantenuta nella stessa posizione durante l'esame con un reggisonda stereoscopico che premette anche il fine aggiustamento della scansione attraverso viti micrometriche. Le immagini telediastoliche (sincronizzate con il segnale ECG) vengono acquisite su personal computer attraverso un software commerciale. Disegno sperimentale. La risposta endotelio-dipendente è rappresentata dalla dilatazione dell'arteria omerale causata dall'aumento di flusso (FMD) causato dall'iperemia reattiva indotta da 5 minuti (manicotto gonfiato a 250 mmHg) dell'avambraccio. La riposta endotelio-indipendente viene ottenuta somministrando per vai sublinguale una bassa dose (25 µg) di nitroglicerina (NTG). La misurazione delle modificazioni del diametro dell'arteria omerale sono effettuate dalle immagini acquisite con un sistema di analisi computerizzato che riconosce automaticamente le pareti. Il diametro basale viene ottenuto durante un minuto di registrazione prima dell'ischemia o della somministrazione di NTG. La FMD e la risposta alla NTG sono calcolate come massimo incremento percentuale del diametro. Questo studio valuterà la vasodilatazione endotelio-dipendente in una grande popolazione di pazienti con differenti fattori di rischio cardiovascolare. Se i pazienti portatori dell'allele -765C per il gene della COX-2 mostreranno una normale vasodilatazione endotelio-dipendente, sarà confermata l'ipotesi che l'allele -765C esercita un effetto protettivo sulla funzione endoteliale. Inoltre, in un sottogruppo di pazienti sarà anche valutato se questo polimorfismo può influenzare l'effetto acuto (3 ore) o cronico (1 settimana) del trattamento con un COX-2 inibitore sulla funzione endoteliale. In aggiunta agli studi vascolari, saranno valutati i seguenti parametri umorali: - Markers di stress ossidativo: lipoperossidi, malondialdeide, capacità antiossidante totale. - PCR, interleuchina (IL)-6, IL-1β - Estrazione del DNA per la variante -765G>C della COX-2 (sarà eseguita presso l'Unita Operativa dell'Università di Chieti). Studi nell'animale Studio 1. La COX-2/mPGES-1 è coinvolta nelle alterazioni vascolari indotte dall'Ang II ? Animali. Tutti gli esperimenti animali saranno eseguiti seguendo le LineeGuide del Comitato Etico della Comunità Europea. Saranno studiati 4 gruppi di topi adulti (10-12 settimane di età) 1) topi infusi con Ang II (mediante minipompe osmotiche ad infusione sottocutanea, che infonderanno 400 ng/kg/min Ile5-Ang II), 2) topi di controllo trattati con soluzione fisiologica (0.2 ml/hr, mediante minipompe osmotiche), 3) topi knock-out per la mPGES-1, trattati con Ang II, 4) topi knock-out per la mPGES-1, trattati con soluzione fisiologica. I topi saranno trattati per 2 settimane. La pressione arteriosa sistolica sarà misurata settimanalmente con il metodo tail-cuff. Dopo il periodo di trattamento, gli animali saranno sacrificati e sarà raccolto il sangue per il dosaggio di alcuni parametri di infiammazione (interleuchina-6, TNF alfa, Proteina C Reattiva) e di stress ossidativo (TBARS, LOOH). Saranno studiati circa 10-12 topi per gruppo. Modello sperimentale. Gli studi di reattività vascolare saranno eseguiti utilizzando come modello sperimentale il micromiografo a pressione. Questa tecnica consente di studiare la morfologià e la funzionalità delle piccole arterie di resistenza, di diametro compreso tra 150 e 300 µm. Nell'animale, sarà isolata la terza branca di diramazione dell'arteria mesenterica, nella porzione prossimale dell'intestino. I segmenti di arteria (circa 2 mm di lunghezza) saranno accuratamente liberati dal tessuto connettivale con l'ausilio di un microscopio, e quindi posizionati in una apposita camera ed incannulati alle due estremità a due microcannule di vetro e legati ad esse mediante un filo di seta. All'interno della camera il vaso sarà tenuto immerso in una soluzione contenente liquido di Krebs arricchito con una miscela contenente 95% di aria e 5% di CO2 , ad un pH di 7.4 - 7.45 ed ad una temperatura costante di 37°C. Gli studi saranno eseguiti mantenendo il vaso ad una pressione costante di 45 mmHg. Con l'ausilio di un microscopio ottico e di una telecamera sarà possibile visualizzare il vaso su un monitor, mentre con un software sarà possibile misurarne le modificazioni del diametro. Dopo aver pre-contratto il vaso con noradrenalina (10-6 mol/L), gli studi di funzionalità endoteliale saranno eseguiti osservando le modificazioni del diametro del lume in seguito alla infusione extraluminale di agonisti ed antagonisti endoteliali. Valutazione della funzione endoteliale, della biodisponibilità di NO e del ruolo della COX-2 Ogni vaso sarà sottoposto ad una curva concentrazione-risposta (infusioni a concentrazioni incrementali logaritmiche) dei seguenti agonisti: - infusione di nitroprussiato di sodio (da 10-8 a 10-4 mol/L x 4 minuti ogni dose), un vasodilatatore endotelio-indipendente - infusione di acetilcolina (da 10-9 a 10-4 mol/L x 4 minuti ogni dose), un vasodilatatore endotelio-dipendente. La curva concentrazione-risposta all'acetilcolina sarà eseguita in condizioni basali e ripetuta in presenza di: - L-NMMA (10-4 mol/L, pre-infusa per 30 minuti), un antagonista competitivo dell'enzima NO sintetasi. - DFU (10-6 mol/L, pre-infusa per 30 minuti), un inibitore selettivo della COX-2. - Infusione simultanea di L-NMMA e DFU. Dopo queste valutazioni funzionali, saranno valutate anche le alterazioni vascolari strutturali, mediante il calcolo del rapporto della tonaca media e del lume del vaso (M/L) e dell'area traversa della tonaca media (MCSA). Per ottenere questo, i vasi saranno perfusi con liquido di Krebs privo di Ca2+ e contenente 10 mmol/L di EGTA, per 30 minuti. Inoltre, nelle arteriole mesenteriche di resistenza provenienti dai quattro gruppi di topi saranno anche valutati i seguenti parametri strutturali e molecolari (le analisi saranno eseguite presso l'Unita Operativa dell'Università di Chieti): - Espressione dell'mRNA per la COX-2 e mPGES-1, valutato mediante RT-PCR. - Analisi immunoistochimica per la localizzazione della COX-2 e del mPGES-1 nella parete vascolare - Analisi del deposito di collagene tipo I/III nella parete delle arteriole mesenteriche, mediante microscopio confocale laser I risultati di questo studio confermeranno la presenza di una ridotta funzione endoteliale nei topi trattati con Ang II rispetto ai controlli. Un ridotto effetto inibitorio della L-NMMA sulla acetilcolina indicherà una ridotta biosponibilità di NO nei topi trattati con Ang II. L'effetto di potenziamento del DFU sull'acetilcolina sarà considerato indicativo di un coinvolgimento della COX-2 nella disfunzione endoteliale indotta da Ang II. Se nei vasi patologici sarà osservata una ridotta biodisponibilità di NO ed un coinvolgimento della COX-2, l'esperimento finale con la presenza contemporanea di L-NMMA e DFU dovrebbe indicare se che una aumentata attività della COX-2 sia direttamente responsabile della ridotta disponibilità di NO. Questa ipotesi dovrebbe essere supportata dai risultati ottenuti nei topi KO, in cui gli effetti negativi sulla parete del vaso dovrebbero essere meno evidenti. Un aumento delle M/L senza o con aumentata MCSA nei vasi mesenterici dei topi trattati con Ang II sarà considerato un indice di rimodellamento eutrofico od ipertrofico, rispettivamente. Le analisi molecolari e di immunoistochimica permetteranno di valutare il coinvolgimento della COX-2/mPGES-1 e la sua localizzazione. Studio 2. Ruolo dello stress ossidativo sulla disfunzione endoteliale indotta dall'Ang II Utilizzando il medesimo modello sperimentale già descritto, in un esperimento successivo (n=6-8 animali per ciascun gruppo), per valutare una eventuale partecipazione dei ROS sulla disfunzione endoteliale mediata dall'Ang II, la curva concentrazione-risposta all'acetilcolina sarà eseguita in condizioni basali e ripetuta in presenza dell'antiossidante acido ascorbico (10-2 mol/L; con 30 minuti di preincubazione). Inoltre, per valutare se la ridotta biodisponibilità di NO nei topi infusi con Ang II possa essere attribuita ad una aumentata produzione di ROS, la curva concentrazione-risposta all'acetilcolina sarà ripetuta durante simulanea incubazione con L-NMMA e acido Ascorbico. Successivamente, per valutare se la COX-2 sia implicata nella produzione dei ROS, i vasi mesenterici ottenuti da un ulteriore gruppo di topi infusi con Ang II (n=6) saranno studiati con acetilcolina anche in presenza di simultanea incubazione con DFU e acido ascorbico. Studio 3. La overespressione di COX-2/mPGES-1 è mediata dai recettori AT-1 dell'Ang II ? Se sarà dimostrato che una aumentata espressione di COX-2/mPGES-1 sia responsabile di almeno alcuni degli effetti negativi dell'Ang II sulla parete vascolare, sarà eseguito uno studio aggiuntivo per valutare se queste alterazioni vascolari siano mediate dai recettori AT-1 dell'Ang II. Pertanto, un gruppo aggiuntivo di topi infusi con Ang II saranno trattati per 2 settimane con irbesartan, un AT-1 antagonista. Per escludere un effetto legato alla riduzione della pressione arteriosa, un altro gruppo di topi sarà trattato con idralazina. Questo studio sarà eseguito utilizzando lo stesso modello sperimentale. Saranno inoltre ripetuti gli stessi esperimenti (già descritti nello studio 1) per valutare la funzione e la struttura vascolare, nonché saranno valutati i medesimi parametri strutturali e molecolari.