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Programma di ricerca
ISOLAMENTO, CARATTERIZZAZIONE E DIFFERENZIAMENTO DI CELLULE STAMINALI DA POLPA DENTARIA UMANA
Università di riferimento
Seconda Università degli Studi di NAPOLI -
DISCIPLINE ODONTOSTOMATOLOGICHE E CHIRURGICHE - CASERTA(CE)
Responsabile dell'Unità di ricerca
Fernando GOMBOS
Descrizione
Scopo della ricerca proposta è quello di coltivare polpa dentaria proveniente da denti decidui e permanenti al fine di isolare e caratterizzare cellule staminali da poter adoperare successivamente per il loro differenziamento in senso osteogenico mediante l'uso di un polimero lattico-coglicolico in un apparato di rotazione a bassa velocità, ciò al fine di ottenere un tessuto idoneo a futuri reimpianti ossei. La nostra unità operativa procederà pertanto dapprima alla estrazione di polpa dentaria proveniente da: -terzi molari inclusi di soggetti di età compresa tra i 18 ed i 30 anni, ovvero da -decidui estratti per trattamento ortodontico o in fase esfoliativa, da soggetti di età compresa fra i 6 ed i 12 anni; tutti sani per patologie sistemiche, orali e dentarie. Ciascun elemento dentario verrà deterso mediante clorexidina 0.2% e la polpa dentaria verrà estratta dopo apertura della camera pulpare mediante fresa sterile. Il prelievo verrà effettuato mediante escavatore dentinale, preventivamente sterilizzato. Successivamente si procederà alla digestione della polpa in una soluzione contenente 4 ml di PBS, 0,4 ml di penicillina (100U/ml)/streptomicina (500microgrammi/ml) e 0,6 ml di claritromicina contenente collagenasi I (3mg/ml) e dispasi (4mg/ml), per 1 h a 37°C. Dopo aver bloccato la reazione di digestione mediante 50 ml di mezzo di coltura (alfa-MEM con aggiunta di FCS 20%, acido L-ascorbico 2-fosfato 100 microM, L-glutamina 2mM, penicillina 100 U/ml, streptomicina 100 microg/ml), la soluzione verrà filtrata (Falcon strainer 70 micrometri) e successivamente posta in coltura (in piastre multiwell o flasks). Il mezzo di coltura verrà rinnovato ogni 3 giorni e la coltura, effettuata in incubatore a 37°C in presenza di CO2 5%, verrà continuata per due settimane. Campioni pari a 500.000 cellule per well verranno selezionati al citofluorimetro con cell sorter (FACscan Beckman Dickinson) dopo essere stati trattati con anticorpi rabbit anti-human, coniugati: SCA-1, CD-45; c-Kit, SSEA-1,SSEA-4, CD-34 preincubati per 30 minuti. Successivamente le cellule ottenute dopo cell sorter saranno suddivise in gruppi a seconda della positività e coltivate, insieme a controlli negativi e positivi, per ulteriori 15 giorni, nel mezzo di coltura (alfa-MEM con aggiunta di FCS 10%, acido L-ascorbico 2-fosfato 100 microM, L-glutamina 2mM, penicillina 100 U/ml, streptomicina 100 microg/ml), con l'aggiunta di KH2PO4 1.8 mmol/L e desametasone sodio fosfato 10(-8) mol/L. Le cellule dopo ulteriori 15 giorni saranno poste in agitatore cellulare rotante (Roller apparatus) alla velocità di 6 giri per minuto, in presenza di un 0.1g/100.000 cellule di un polimero (85:15 polylactic DL lactide co-glycolic)e ne verrà osservata la capacità di ricostruzione tridimensionale del tessuto. Inoltre le cellule saranno osservate anche mediante tecniche per l' evidenziazione della proliferazione cellulare (BrdU), necrosi ed apoptosi (DAPI). Verranno inoltre effettuati i seguenti saggi: -citochimica per la fosfatasi alcalina (ALP); -immunoistochimica per la microscopia a fluorescenza adoperando i medesimi anticorpi per la citofluorimetrìa ed i seguenti anticorpi per una precisa caratterizzazione: CD14, CD44, integrin beta 1, VCAM-1, MyoD, alpha SM actina, neurofilam., MUC-18, collagen I-II-III, osteocalcina, osteonectina, BSP, osteopontina, fosfatasi alcalina, PPAR gamma, FGF-2 ; -microscopia elettronica in trasmissione. Da campioni di cellule verrà estratto DNA ed RNA da inviare ad altra unità operativa per saggi bio-molecolari. Ciascun esperimento sarà effettuato in quadruplicato onde ottenere l'ottimale standardizzazione.
