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Un'attrattiva delle cellule staminali della polpa dentaria è data dal fatto che, durante la vita dell'individuo, vi è la perdita dei denti decidui la cui polpa può rappresentare una fonte potenziale di cellule staminali da conservare ed usare al momento opportuno senza doverle isolare da organi o tessuti periferici. Inoltre poichè queste cellule provengono dallo stesso individuo non vi è nessun problema di rigetto da parte del sistema immunitario. Il progetto di ricerca della nostra unità si basa su due punti qualificanti: a) l'impiego delle cellule staminali isolate dalla polpa dentaria per la ricostruzione degli elementi parodontali, sfruttando la loro potenzialità di differenziare in elementi mesenchimali; b) lo studio della possibilità di realizzare una banca delle cellule staminali umane della polpa dentaria come riserva di cellule potenzialmente utilizzabili in terapia. a) Impiego delle cellule staminali isolate dalla polpa dentaria per la ricostruzione degli elementi parodontali La perdita di supporto del dente consiste in una serie di alterazioni che riguardano tutte le componenti del parodonto (gengiva, cemento, legamento alveolo-dentale e osso alveolare), secondaria a patologie di diversa etiologia, genericamente definite come parodontiti. E'comune la rilevazione di difetti osssei e la presenza clinica di tasche parodontali, soggette ad ulteriori infiammazioni ed infezioni. In soggetti già trattati con "root planing" la persistenza di tasche ossee richiede un intervento di chirurgia parodontale. Tuttavia è frequente il riscontro dell'impossibilità di rigenerazione del legamento alveolo - dentale e del cemento. Sarebbe quindi opportuno poter disporre di precursori dei cementoblasti che, opportunamente differenziati in vivo o in vitro, possano ricostruire cemento, contribuire alla rigenerazione del legamento, comunque contribuire al riempimento del difetto osseo e, quindi, ripristinare il supporto del dente. Nella prima fase di questa ricerca si cercherà di individuare mediante marcatura metabolica con precursori radioattivi e western blot se le cellule derivate dagli elementi staminali della polpa dentaria, isolate come descritto dalla unità A, sono in grado di produrre proteine tipiche dei fibroblasti quali il collagene (di tipo I e tipo III) o delle cellule del legamento parodontale come l'osteopontina e l'osteocalcina o la fosfatasi alcalina. Se questi esperimenti daranno esito positivo si cercherà di individuare e selezionare queste cellule mediante clonazione. Sulle cellule così isolate saranno sperimentati fattori di crescita (ad esempio TGF-beta1, PDGF- BB) per valutare il loro effetto mitogenico e/o differenziativo. Inoltre durante l'impianto delle cellule staminali cresciute sulla matrice tridimensionale (vedi progetto unità A) nell'animale da esperimento (topi nudi) sarà valutata la possibile ricostruzione degli elementi ancoranti il dente mediante le tecniche di istologia classica. In una seconda fase le cellule staminali della polpa mantenute in coltura saranno infettate con un virus veicolante il gene BMP-7 in quanto è stato dimostrato da Ripamonti & Reddi (Arch Oral Biol Med, 8: 154-63, 1997) che BMP-7 veicolata da una matrice collagenica è capace di indurre neoformazione di cemento e inserzione di fibre di Sharpey verosimilmente per reclutamento di nuove cellule a potenzialità cementogenica. In un altro esperimento fibroblasti singenici, ottenuti dal derma, sono modificati ex vivo con un adenovirus codificante BMP-7 e cresciuti su di una matrice gelatinosa. Poi sono stati trapiantati in ratti aventi delle cavità ossee nell'osso alveolare della mandibola. L'impianto della matrice contenente le cellule ingegnerizzate ha indotto un notevole miglioramento della neoformazione ossea e della formazione del cemento (Kresbach et al, Human Gene Therapy 14: 591-597, 2003). Il nostro intento è quello di ripetere lo stesso esperimento usando delle cellule ingegnerizzate staminali per migliorare l'efficienza del processo insieme con l'impianto di un elemento dentario nella cavità ossea. b) Realizzazione di una banca delle cellule staminali umane della polpa dentaria Le cellule staminali presenti nella polpa dentaria coltivate come in Miura et al.2003 saranno fatte crescere a densità clonale ed i singoli cloni caratterizzati per FACS per l'espressione di marcatori di superficie come CD34, c-kit, CD-133 (marcatori di staminalità), CD-45, CD-31 e VEGF-R (marcatori endoteliali), STRO-1 e CD146 (marcatori precoci di cellule staminali mesenchimali). Le cellule ottenute dalla polpa dentaria saranno separate tramite l'identificazione dei loro antigeni di membrana specifici. I singoli cloni verranno conservati in azoto liquido per essere disponibili. I cloni mantenuti in coltura, dopo essere stati tenuti ciclanti in coltura, saranno testati per misurare in modo quantitativo la loro capacità di conversione in diversi tipi istologici mesenchimali. CONVERSIONE "IN VITRO" Si procederà secondo i seguenti protocolli: 1) Test per la capacità delle cellule ottenute di convertire "in vitro" al fenotipo osteogenico: Le cellule vengono trattate con 1 ng/ml di BMP2 in mezzo di coltura completo per 5 giorni. Il BMP2 è aggiunto ogni giorno. Al termine del periodo di trattamento vengono fissate e colorate per la fosfatasi alcalina (ALP) oppure analizzate per RT-PCR per l'espressione di marcatori osteogenici quali l'osteocalcina. 2) Test per l'induzione del fenotipo adipocitario: le cellule vengono trattate con 10 ng/ml di desametazone sempre per 5 giorni addizionando il fattore tutti i giorni. Dopo la fissazione viene analizzata la morfologia cellulare per vedere se si sono evidenziati adipociti e le capsule colorate con oil red. 3) Test per l'induzione del differenziamento osteoclastico: le cellule vengono trattate con 10-8 M 1,25 (OH)2 vitamin D3. Dopo la fissazione si rileva se sono posite per la colorazione TRAP. 4) La capacità di queste cellule di essere reclutate al fenotipo miogenico scheletrico o cardiaco o emopoietico può essere osservata mediante co-cultura. Le cellule umane poste in cocultura con cellule murine possono essere identificate poiché esistono anticorpi specifici per le proteine della lamina nucleare che non cross-reagiscono con il nucleo di topo. Alternativamente le cellule umane possono essere infettate per 4 ore con un vettore lentivirale pRRLsinPPT-PGK.GFP per marcare le cellule umane con GFP (Follenzi et al., 2000). Generalmente circa il 90% della popolazione infettata esprime GFP nel citoplasma delle cellule GFP+. Le cellule umane sono poste in cocultura con una linea miogenica murina quale le C2C12 o con cardiociti da ratto neonato o con cellule di midollo osseo adulto murino in condizioni di coltura già descritte (Dexter and Testa, 1976). Dopo periodi diversi le culture sono analizzate per la coespressione di marcatori umani specifici per la lamina nucleare e di marcatori specifici come la catena pesante della miosina scheletrica o la troponinaI cardiaca o CD45 sia per immunofluorescenza sia per FACS. CONVERSIONE "IN VIVO" Per poter eseguire tests di conversione in vivo è necessario in primo luogo analizzare la capacità tumorigenica di queste cellule reinserendole in topi nudi immunodeficienti. In caso di tumorigenicità nulla e se le cellule ottenute mostrano capacità di convertire in vitro in muscolo scheletrico si può procedere ad analizzare la loro capacità di convertire in muscolo scheletrico in vivo. E' stato dimostrato (Sampaolesi et.al,2003) che i mesoangioblasti, un tipo di cellule staminali associate ai vasi, iniettati all'interno della arteria femorale sono capaci di correggere funzionalmente e morfologicamente il fenotipo distrofico in muscoli di topi adulti immunocompetenti-meno sarcoglicano-meno (-SG). Ci proponiamo di iniettare le nostre cellule marcate con timidina C14 nella arteria femorale di topi immunocompetenti-meno ai quali sia stato precedentemente procurato un danno nel muscolo situato a valle della inezione cellulare mediante cardiotossina e di verificare se le cellule sono rintracciabili nel muscolo danneggiato. Se le cellule vengono rintracciate si può procedere ad un secondo tipo di analisi: cellule staminali rese GFP positive possono essere iniettate nelle condizioni e secondo le modalità precedentemente descritte. Il muscolo danneggiato verrà prelevato, fissato, eseguite delle sezioni seriali per evidenziare la localizzazione delle cellule iniettate e per vedere se partecipano alla riparazione del muscolo danneggiato o entrano nel connettivo.
