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BIOTECNOLOGIE PER IL MONITORAGGIO AGROALIMENTARE E AMBIENTALE - REGGIO CALABRIA(RC)
La ricerca si propone di svolgere uno studio integrato degli aspetti morfo-funzionali dell'apparato radicale in piante erbacee in presenza di composti di natura allelopatica e/o di sostanze umiche solubili presenti nella rizosfera. Lo scopo è quello di ottenere una maggiore conoscenza sugli effetti indotti dagli allelochimici individualmente e/o in combinazione con sostanze umiche e di contribuire a chiarirne i loro meccanismi d'azione la cui comprensione è fondamentale al fine di una più corretta e mirata utilizzazione quali "potenziali erbicidi" in un'agricoltura a basso impatto ambientale. L'obiettivo della ricerca si concretizzerà nei seguenti punti: i) quantificare la distribuzione spaziale della velocità di allungamento lungo l'asse radicale in presenza di composti di natura allelopatica e/o di sostanze umiche, ii) descrivere attraverso l'esame dei parametri morfo-topologici l'evoluzione dell'intero apparato radicale ed identificare tipi di radici sensibili in presenza di tali composti; iii) valutare gli effetti di tali composti sulla regolazione dell'assorbimento del nitrato e sull'attività dell'H+-ATPasi del plasmalemma sull'intero apparato radicale; iv) analizzare il meccanismo dell'assorbimento del nitrato su tipi di radice e/o tratti discreti della stessa e la variazione spaziale dell'attività della H+-ATPasi del plasmalemma lungo l'asse radicale in presenza di composti di natura allelopatica e/o composti umici solubili. Nella prima fase della ricerca, corrispondente al primo anno del progetto, la sperimentazione consisterà nella descrizione dell'evoluzione dell'architettura e della morfologia dell'apparato radicale e, attraverso analisi cinematica, della distribuzione spaziale della velocità di allungamento lungo l'asse radicale, trattate con differenti concentrazioni di sostanze di natura allelopatica e/o sostanze umiche solubili. Partendo dalle nostre conoscenze sugli effetti indotti dalla cumarina sull'apparato radicale, lo studio sarà esteso anche ai suoi derivati ed a composti fenolici semplici maggiormente presenti nella rizosfera. Saranno studiati gli effetti di sostanze umiche naturali e di sintesi. Tali composti saranno saggiati, a differenti concentrazioni, su due specie erbacee, l'Arabidopsis thaliana ed il mais. L'Arabidopsis thaliana, rappresenta, sia per la rapida crescita sia per il semplice apparato radicale di tipo fittonante, un sistema ottimale di studio e di rapido screening. Inoltre, l'uso di tale pianta può offrire nuove opportunità d'indagine grazie alla disponibilità di numerosi mutanti relativi allo sviluppo dell'apparato radicale. Il mais, caratterizzato da radice primaria, seminale e nodale aventi differente origine, anatomia, sviluppo e fisiologia, è un utile sistema per valutare gli effetti degli interferenti sui diversi tipi di radice. Le piante di mais saranno allevate in un sistema idroponico, mentre l'Arabidopsis thaliana sarà cresciuta su terreno agarizzato in piastre Petri. In entrambe i sistemi, la soluzione nutritiva sarà addizionata con differenti concentrazioni di composti allelopatici e/o sostanze umiche, ed a tempi definiti, si effettuerà la raccolta delle piante ed il loro apparato radicale verrà sottoposto ad analisi morfo-topologica. L'analisi morfologica prevede misure di parametri quali la lunghezza, l'area superficiale, il diametro, la lunghezza specifica, la finezza e la densità di tessuto dei differenti tipi di radice (seminale, nodale, avventizie, laterali di diverso ordine, ecc.) costituenti l'apparato radicale. Sarà effettuata inoltre la misura della lunghezza, dell'area superficiale e della densità dei peli radicali. L'analisi dell'architettura radicale prevede la valutazione di parametri topologici quali la lunghezza, l'area superficiale e il diametro dei differenti links (segmenti di radice: vedi Fitter, 1986) e l'indice topologico al fine di definire il modo di ramificazione dell'apparato radicale, herringbone- o dicotomico-simile. Le analisi della morfologia e dell'architettura radicale saranno effettuata mediante un sistema informatico di analisi d'immagine specifico: WinRHIZO system (Régent Instrument, Canada) già disponibile presso la proponente unità di ricerca. Per l'analisi morfologica dell'apparato radicale di Arabidopsis thaliana e per l'analisi dei peli radicali sarà inoltre utilizzato un microscopio digitale che sarà collegato direttamente con il WinRHIZO system. Il profilo della velocità di crescita lungo l'asse radicale verrà descritto attraverso analisi cinematica accoppiata ad analisi di immagine (Van der Weele et al., 2003) su radici di Arabidopsis thaliana e di mais allevate su terreno agarizzato in presenza di differenti concentrazioni di composti allelopatici ed in presenza di sostanze umiche. Nella seconda fase, corrispondente al secondo anno del progetto, individuati gli allelochimici e le concentrazioni capaci di indurre modificazioni morfo-topologiche a carico dell'apparato radicale in presenza o meno di sostanze umiche, sarà valutato il loro effetto sulla regolazione dell'assorbimento del nitrato e sull'attività e sull'espressione dell'H+-ATPasi della membrana plasmatica sull'intero apparato radicale di piantine di mais. Tali attività fisiologiche possono essere considerate utili indici della funzionalità dell'apparato radicale ai fini della nutrizione minerale delle piante. La stima della velocità di assorbimento del nitrato sarà effettuata misurando, attraverso analisi colorimetrica o spettrofotometricamente, la scomparsa del nitrato da una soluzione a concentrazione nota di tale ione. La misura sarà effettuata a tempi fino ad un massimo di 48 ore in modo da poter evidenziare il processo di induzione e di deinduzione della velocità di assorbimento del nitrato. Successivamente, tale processo sarà descritto attraverso analisi di regressione non-lineare che ci permetterà di quantificare i seguenti parametri: velocità massima di assorbimento del sistema inducibile, velocità di assorbimento del sistema costitutivo, tempi di permanenza del processo di induzione e di deinduzione, quantità di nitrato assorbito entro un determinato periodo di tempo. I parametri cinetici, Vmax e Km, del trasporto del nitrato saranno stimati attraverso regressione non-lineare utilizzando l'equazione di Michaelis-Menten. L'attività dell'H+-ATPasi del plasmalemma sarà effettuata su vescicole di membrana plasmatica isolate da radice di piantine di mais e l'enzima presente sarà quantificato mediante analisi western. In una fase successiva, verranno analizzati il meccanismo dell'assorbimento del nitrato su tipi di radice e/o tratti discreti della stessa e la variazione spaziale dell'attività della H+-ATPasi del plasmalemma lungo l'asse radicale in presenza di composti allelopatici e/o di sostanze umiche. Per la misura della velocità di assorbimento del nitrato per tratti discreti di radice, sarà utilizzata una camera in plexiglass opportunamente divisa in pozzetti (2x2 cm) in modo da realizzare piccoli microambienti adeguatamente isolati, già collaudata in sperimentazioni precedenti. La valutazione dell'assorbimento del nitrato e la sua regolazione verranno effettuate come sopra descritto. L'attività dell'H+-ATPasi della membrana plasmatica sarà effettuata con tecnica di immunolocalizzazione su sezioni di tessuto radicale (Villalba, et al., 1991)
