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BIOTECNOLOGIE PER IL MONITORAGGIO AGROALIMENTARE E AMBIENTALE - REGGIO CALABRIA(RC)
L'obiettivo dell'attività di ricerca dell'unità di Reggio Calabria sarà di valutare l'intensità e la persistenza delle perturbazioni prodotte sulle caratteristiche chimiche e microbiologiche del terreno a seguito dell'applicazione di differenti tecniche di geodisinfezione con vapor d'acqua in combinazione con la distribuzione di sostanze a reazione esotermica. A tal fine verranno utilizzati come indicatori di risposta del suolo e della componente microbica ai trattamenti, un ampio set di parametri chimici, microbiologici e molecolari, opportunamente selezionati. La sperimentazione alla quale parteciperanno le altre unità di ricerca, ciascuna secondo le proprie competenze, riguarderà trattamenti diversificati di geodisinfezione: sistemi diversi di diffusione del vapore, differente velocità di avanzamento della macchina operatrice, distribuzione di dosi diverse di sostanza a reazione esotermica, tipologie diverse di suolo, presenza di copertura pacciamante. Le prove saranno condotte utilizzando diversi allestimenti sperimentali: (i) sistemi modello di tipo confinato, costituiti da contenitori in plastica, riempiti con suoli di natura diversa, e sottoposti a trattamenti diversificati in condizioni operative (temperatura, umidità, tipo e quantità di sostanze a reazione esotermica, etc.) controllate; (ii) sistemi intensivi ad indirizzo orticolo in ambiente protetto e (iii) sistemi colturali di pieno campo a diverso ordinamento colturale. Gli allestimenti sperimentali saranno ospitati presso una azienda specializzata ad indirizzo orticolo situata presso Firenze. Oltre che presso altre aziende, per scegliere le quali componenti di altre unità di ricerca stanno effettuando una indagine conoscitiva in ambito nazionale. I compiti dell'unità di ricerca di Reggio Calabria saranno pertanto i seguenti: (i) utilizzare tecniche di indagine molecolare per monitorare le variazioni nella struttura molecolare della comunità batterica del suolo; (ii) stimare le variazioni quantitative della popolazione batterica nei suoli in esame mediante tecniche microbiologiche convenzionali di conta su piastra; iii) monitorare le variazioni nelle proprietà chimiche del suolo mediante l'impiego di un ampio set di indicatori descrittivi delle condizioni di fertilità chimica e fisica del suolo (tessitura, pH, conducibilità elettrica, contenuto di sostanza organica, azoto totale, capacità di scambio cationico, grado di saturazione in basi, potassio scambiabile, fosforo assimilabile, azoto inorganico di scambio, con determinazione sia della forma nitrica che ammoniacale); (iv) relazionare le determinazioni relative alle proprietà chimico-fisiche, microbiologiche e molecolari del suolo con le modalità del trattamento applicato; (v) confrontare ed integrare i risultati ottenuti dalla proponente unità di ricerca con i risultati forniti dalle altre unità operative afferenti al programma di ricerca. I suoli verranno campionati secondo le procedure standard, insieme con i relativi suoli di controllo ed un numero opportuno di replicazioni. I prelievi saranno eseguiti prima di ogni trattamento e dopo almeno 7 e 15 giorni dal tempo zero. Saranno inoltre valutati effetti di lungo periodo con campionamenti ripetuti ad intervalli di tempo oltre i 60 giorni. Le analisi chimiche saranno eseguite secondo le metodiche ufficiali. Le analisi saranno tese a valutare le modificazioni nel grado di reazione del suolo, oltre alle variazioni dei "pool" scambiabili di macronutrienti (azoto, fosforo e potassio), indotte a seguito dell'aggiunta al terreno dei cationi di scambio (calcio, potassio) distribuiti con le sostanze a reazione esotermica. La determinazione della capacità di scambio cationico e del grado di saturazione in basi potrà fornire una misura quantitativa della reattività del complesso di scambio e della capacità tampone del terreno. L'analisi complessiva dei parametri chimici fornirà una lettura delle variazioni della fertilità fisica e chimica, e dei potenziali rischi connessi alla lisciviazione dei nutrienti solubili. Le variazioni quantitative nella carica batterica totale saranno determinate mediante sistemi convenzionali di conta indiretta utilizzando terreni colturali agarizzati. La metodica, pur presentando dei limiti applicativi legati alla coltivabilità delle specie batteriche del suolo, tuttavia fornisce un dato quantitativo indicativo relazionabile con la dimensione complessiva della popolazione batterica. Il DNA di origine batterica sarà estratto dal terreno mediante il metodo della estrazione indiretta, in grado di estrarre il DNA dalla frazione fisiologicamente attiva della microflora del suolo. Il metodo prevede la separazione delle cellule batteriche dalle particelle solide del suolo mediante centrifugazione frazionata, seguìta dalla lisi cellulare provocata da un trattamento meccanico (agitazione violenta con microsfere di vetro), con conseguente rilascio di DNA. Le sostanze interferenti coestratte (composti umici, polisaccaridi, glicoproteine) saranno rimosse mediante tecniche di purificazione per precipitazione con cloruro di cesio e successiva filtrazione con sistemi di tipo cromatografico. Poiché la presenza di contaminanti organici coestratti dal suolo condiziona fortemente la possibilità di applicare con successo le tecniche di caratterizzazione del materiale nucleare estratto (ad es. l'amplificazione genica mediante PCR), la qualità del materiale estratto verrà analizzata mediante elettroforesi su gel di agarosio e letture spettrofotometriche. In particolare verranno determinate le rese (µg DNA g-1 suolo), le dimensioni medie (lunghezza dei frammenti in kb) ed il livello di purificazione della miscela dei frammenti di DNA ottenuti. Aggiornamenti alle metodologie correnti saranno eventualmente messi a punto nel corso della ricerca. Il DNA estratto e purificato verrà successivamente sottoposto ad amplificazione genica, mediante reazione a catena della polimerasi (PCR), di specifiche sequenze nucleotidiche comprese nella regione genica 16S rDNA, codificante per la sintesi dell'RNA ribosomiale della subunità piccola (30S) del ribosoma procariotico. Infatti, come attestato da recenti studi di tassonomia molecolare, all'interno del 16S rDNA si distinguono alcune regioni altamente conservate (altissime omologie di sequenze intra e interspecie) le cui differenze, dovute a variazioni puntiformi di basi azotate, aumentano solo con la distanza filogenetica degli individui. La miscela di frammenti prodotti in seguito all'amplificazione del DNA batterico estratto dal suolo sarà analizzata mediante separazione elettroforetica su gel di poliacrilammide con gradiente di agente chimico di denaturazione (DGGE), capace di risolvere frammenti di DNA della stessa dimensione ma con differente composizione in basi azotate. L'analisi dunque fornisce una serie di profili elettroforetici con una distribuzione caratteristica di bande, ciascuna associabile ad una specie batterica, che nel complesso descrive la struttura molecolare ed il grado di diversità genetica della popolazione microbica presente nel suolo. I livelli di polimorfismo genetico, derivanti dal bandeggio del DNA batterico ottenuto per analisi DGGE, saranno elaborati mediante metodologie statistiche del tipo analisi di raggruppamento (cluster analysis). Ciò permetterà confronti tra suoli sottoposti a trattamenti fitoiatrici differenti. L'impiego combinato delle due tecniche (carica batterica totale e DNA) potrà fornire una doppia lettura, sia quantitativa (biomassa di comunità) che qualitativa (struttura di comunità), della risposta della componente batterica del suolo ai diversi trattamenti. La strumentazione attualmente disponibile presso la proponente unità di Reggio Calabria, è quella di base necessaria per l'estrazione e la caratterizzazione del DNA batterico da suolo e per l'esecuzione della maggior parte delle analisi chimiche. In particolare sono disponibili: spettrofotometri UV-VIS, un omogeneizzatore per l'estrazione del DNA batterico dal suolo, un termoreattore a cicli programmabili per l'amplificazione di DNA mediante reazione a catena della polimerasi (Thermocycler per PCR), il sistema DGGE per la separazione elettroforetica su gel con gradiente chimico di denaturazione, un transilluminatore UV con annesso sistema fotografico per acquisizione di immagine, oltre ad altre apparecchiature minori necessarie per lo svolgimento della presente ricerca. Per l'analisi molecolare si renderà necessario l'acquisto di materiale di consumo monouso, ad alto grado di purezza, costitutito principalmente da kit di purificazione, enzimi, oligonucleotidi e reagenti per biologia molecolare. Per la determinazione dell'azoto inorganico di scambio si prevede l'acquisto di un analizzatore potenziometrico di ioni in soluzione fornito di elettrodi iono-selettivi per l'ammonio e per il nitrato. La collaborazione la sezione operativa di Catanzaro Lido dell'ISSDS potrà fornire le competenze necessarie per l'esecuzione di alcune analisi chimiche del suolo (grado di saturazione in basi e cationi di scambio). Per l'esecuzione delle analisi microbiologiche si prevede l'acquisto di un frigotermostato a temperatura regolabile e l'attivazione di contratti di collaborazione alla ricerca a carico del progetto.
