RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Valorizzazione di specie minori in aree marginali per la produzione di latte ad elevato valore bio-nutrizionale

Università di riferimento

Università degli Studi di FOGGIA - SCIENZE DELLE PRODUZIONI, DELL'INGEGNERIA, DELLA MECCANICA E DELL'ECONOMIA APPLICATE AI SISTEMI AGRO-ZOOTECNICI - FOGGIA(FG)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Agostino SEVI

Descrizione

Le attività dell'U.O. saranno suddivise nelle seguenti 6 fasi, per una durata complessiva di 24 mesi: 1a fase (0-2 mesi): Raccolta di campioni di latte di capra provenienti da razze diverse, allevate nelle regioni dell'Italia meridionale e loro caratterizzazione per la componente chimico-fisica ed igienico-sanitaria mediante le seguenti analisi, da effettuarsi con procedure standard: pH, contenuto in grasso, proteine, lattosio, caseine, sieroproteine, cellule somatiche, conta batterica totale. L'indagine riguarderà alcune razze e popolazioni caprine autoctone della Puglia e del Molise (capra Garganica,capra Vafortorina, capra di Montefalcone) e razze caprine alloctone allevate nelle medesime regioni. 2a fase (3-5 mesi): I campioni di latte caprino, in parte raccolti da questa U.O. ed in parte reperiti dall'U.O. dell'Università del Molise, verranno sottoposti ad analisi elettroforetica su gel di poliacrilamide (PAGE) derivanti dalla polimerizzazione indotta dai radicali liberi di acrilamide e N,N'-metilenbisacrilamide in un tampone specifico. In particolare, si procederà all'ottimizzazione della separazione elettroforetica delle proteine del latte su gel contenenti urea in ambiente alcalino (Urea-PAGE) e su gel contenenti sodiododecil solfato (SDS-PAGE). Le due tecniche, infatti, permettono di ottenere informazione diverse: il tracciato elettroforetico su Urea-PAGE consente di separare le proteine in base alla massa (peso molecolare) e alla carica mentre la separazione su SDS-PAGE, per la capacità del sodio dodecil solfato di mascherare la carica delle proteine, avviene soltanto sulla base del peso molecolare. Per tale ragione, la tecnica su Urea-PAGE consentirà una migliore separazione delle caseine in ragione del peso molecolare ravvicinato (20-25 KDa) con la possibilità di valutare le varianti genetiche delle singole caseine (alfa- β- K), e i frammenti peptidici derivanti dalla loro degradazione (gamma, lambda-components e proteso-peptoni). La separazione su SDS, al contrario, permetterà di visualizzare l'intero spettro proteico: siero albumine, caseine, β-lattoglobuline, alfa-lattoalbumine. In entrambi i casi al termine della corsa elettroforetica le bande che si ottengono vengono visualizzate mediante immersione in una soluzione alcolica ed acida contenente il Coomassie brillant blue. L'elettroforesi su Urea-PAGE verrà ottimizzata a partire dalla metodica di Andrews (1983), la tecnica su SDS-PAGE con la metodica di Laemmli (1970). In considerazione dell'elevato polimorfismo delle caseine si procederà per ciascuna banda proteica all'analisi elettroforetica bidimensionale. 3a fase (6-10 mesi): Al fine di valutare l'effetto sulla risposta immunitaria dei gruppi peptidici visualizzati dal tracciato elettroforetico, saranno preparati degli idrolizzati proteici da testare in vitro su linfociti periferici prelevati da bambini affetti da intolleranza alle proteine del latte vaccino (IPLV). E' stato dimostrato che i linfociti periferici di bambini affetti da IPLV presentano un significativo aumento della produzione di citochine infiammatorie (TNF-alfa; IL-6; IL-1beta, IL10) se stimolati con proteine del latte vaccino (Motrich, 2003), ma mai è stata valutata la secrezione di citochine infiammatorie, in particolare il TNF-alfa, da parte degli stessi linfociti periferici se stimolati da caseine e lattoglobuline di capra. E' stato dimostrato che i linfociti periferici di bambini affetti da IPLV presentano un'aumentata secrezione di TNF-alfa; che potrebbe essere responsabile dell'aumentata permeabilità intestinale nei confronti di macromolecole, con conseguente aumentato rischio di allergizzazione (Hyman, 1994). Pazienti e metodi: saranno reclutati 20 bambini affetti da IPLV a manifestazione gastrointestinale e/o cutanea e/o respiratoria + 20 bambini controllo. Una volta ottenuto da ogni soggetto 10 cc di sangue venoso periferico (i bambini controllo saranno quelli che per altri motivi dovranno essere sottoposti a prelievo ematico), i linfociti periferici saranno isolati da sangue eparinizzato mediante centrifugazione. Una volta isolati, tali elementi cellulari saranno sospesi in mezzo di coltura contenente glutamax, piruvato di sodio, amino acidi non essenziali, penicillina/streptomicina. Dette colture cellulari saranno distribuite in piastre contenenti: 1) caseine bovine, 2) lattoglobuline bovine, 3) miscela di caseine e lattoglobuline bovine, 4) caseine caprine, 5) lattoglobuline caprine, 6) miscela di caseine e lattoglobuline caprine. La secrezione di TNF-alfa in ogni piastra di coltura sarà valutata raccogliendo il sopranatante e testandolo con metodica di chemiluminescenza immunometrica. 4a fase (11-15 mesi): Le "lane" proteiche che hanno evidenziato una reattività ai test in vitro verranno sottoposte ad elettroblotting, ossia a trasferimento su membrana di PVDF (polyvinylidenedifluoride) utilizzando una celletta di trasferimento; al termine della corsa la membrana viene sottoposta a colorazione utilizzando un appropriata soluzione colorante. I peptidi così ottenuti sono collezionati, congelati e sottoposti a sequenziamento a partire dal frammento N-terminale mediante degradazione di Edman con l'impiego di un sequenziatore automatico a fase liquida pulsata che permette di individuare l'identità di sequenza. 5a fase (16-20 mesi): Una volta ottenuta l'identità di sequenza dei singoli peptidi contenuti nelle "lane" proteiche che hanno evidenziato una reattività alla prima serie di test in vitro, si procederà ad un'ulteriore valutazione in vitro degli effetti sul sistema immunitario del bambino, come descritto nella 3a fase. I test effettuati durante questa fase saranno estesi anche ai campioni di latte d'asina raccolti dall'U.O. coordinata dalla Prof.ssa Angela D'Alessandro. 6a fase (21-24 mesi) L'idrolizzato enzimatico dei pepridi bio-attivi individuati verrà sottoposto a passaggio su RP-HPLC della frazione solubile in acido tricloroacetico (TCA 1%). Allo scopo di valutare la massa dei peptidi identificati si procederà alla determinazione mediante spettrometro di massa della frazione N-terminale derivante dall'analisi su RP-HPLC. Contestualmente, durante il primo anno del programma di ricerca, questa U.O. raccoglierà, con cadenza mensile, ed invierà all'U.O. dell'Università del Molise i campioni di latte di capra necessari alla determinazione del contenuto in lattoferrina ed in coniugati dell'acido linoleico (CLA).