RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

LA VALORIZZAZIONE DEI PRODOTTI ALIMENTARI "MADE IN ITALY": IL CASO DELLA GRAPPA

Università di riferimento

Università degli Studi di PADOVA - BIOTECNOLOGIE AGRARIE - PADOVA(PD)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Paolo SPETTOLI

Descrizione

Il progetto proposto si inserisce in un filone di ricerca che già da alcuni anni viene seguito dalle sezioni di Tecnologie Alimentari e di Microbiologia del Dipartimento di Biotecnologie Agrarie dell'Università di Padova, in collaborazione con importanti distillerie venete. In conseguenza di ciò, il gruppo di ricerca possiede già del materiale biologico proveniente dalle vendemmie degli anni precedenti e dei dati preliminari da esso ricavati. Il presente progetto si avvarrà pertanto anche di questo materiale che si aggiungerà a quello che si potrà ottenere dalla vendemmia 2004. Lo schema dell'attività di ricerca che si intende condurre nei due anni del progetto è di seguito descritto, suddiviso nei punti principali. 1. Indagine sulla presenza di sostanze tossiche e sulle attività enzimatiche responsabili della loro produzione La prima fase del lavoro riguarderà un'accurata ricerca bibliografica, che verrà tenuta costantemente aggiornata nel corso dell'intero progetto. Il primo passo del lavoro sperimentale sarà volto a rilevare sul materiale biologico l'effetiva presenza di metanolo ed etil-carbammato, due sostanze legate ai distillati la cui tossicità è accertata. Dal punto di vista microbiologico, questa fase della ricerca verrà condotta su lieviti di collezione e commerciali. Inoltre verranno esaminati gli isolati naturali ottenuti da una precedente sperimentazione presso distillerie venete. Da queste vinacce sono stati caratterizzati oltre mille isolati di lievito, prelevati durante la fase di stoccaggio delle vinacce che ne precede la distillazione. Verranno messi a punto ed utilizzati test su piastra o in liquido che permettano di testare rapidamente un numero considerevole di ceppi. Per quanto riguarda l'apporto della componente vegetale alla produzione di dette sostanze, gli studi preliminari si focalizzeranno sull'individuazione di attività enzimatiche coinvolte nella loro formazione, utilizzando vinacce di uva Prosecco conservate congelate. La scelta del sistema di estrazione (enzimatico, chimico, fisico) dovrà considerare la presenza nel materiale vegetale di una consistente frazione fenolica in grado di combinarsi con quella proteica. Successivamente si adotteranno saggi spettrofotometrici per quantificare la componente enzimatica nell'estratto ottenuto. Questa prima fase dell'analisi consentirà di ottenere un quadro generale della situazione, che fornirà informazioni sulla diffusione e sull'entità di tali sostanze nel materiale naturale. 2. Individuazione e caratterizzazione delle attività enzimatiche responsabili della produzione di metanolo ed etil-carbammato, e dei rispettivi determinanti genici. Sulla base dei dati ottenuti al punto precedente, si procederà ad uno studio più approfondito delle attività metaboliche responsabili della produzione delle sostanze tossiche. In particolare si studieranno le attività pectin-metil-esterasiche (PME), responsabili della produzione di metanolo e le attività legate al metabolismo dell'arginina, collegato alla produzione di etil-carbammato. Questi studi verranno condotti sia sul materiale vegetale che sui lieviti. Il lavoro si avvarrà dell'esecuzione di zimogrammi che permetteranno di rilevare il numero e la diversità delle isoforme coinvolte. Questa fase potrebbe portare all'individuazione di pattern enzimatici che nel caso dei lieviti potrebbero essere specifici di ciascun ceppo o gruppo di ceppi, e nel caso dell'uva di un particolare vitigno. Parallelamente all'analisi biochimica, si avvierà lo studio genetico. Dalle ricerche in banche dati verranno raccolte le informazioni disponibili sui determinanti genici delle attività suddette. Successivamente, dall'analisi bioinformatica si cercheranno di individuare e costruire delle sonde geniche specifiche, in modo da ottenere dal materiale informazioni complementari a quelle enzimatiche. Si potranno identificare le diverse forme alleliche sulla base delle sequenze nucleotidiche ed eventualmente sviluppare delle sonde geniche in grado di discriminare le attività di origine microbica da quelle di origine vegetale. I risultati ottenuti daranno utili informazioni che verranno utilizzate per la selezione di ceppi di lievito con caratteristiche specifiche per il settore della distillazione da impiegare negli eperimenti al successivo punto 4. 3. Studio della componente batterica della vinaccia in relazione alla produzione di sostanze tossiche. Il materiale microbiologico attualmente in nostro possesso riguarda esclusivamente ceppi di lievito, mentre mancano completamente informazioni riguardo ai batteri, che sono un'altra importante componente della microflora della vinaccia. Questa parte del progetto potrà iniziare solo con gli esperimenti pianificati per la prossima vendemmia, dato che non sono ancora stati fatti dal nostro gruppo isolamenti di batteri. Sulla nuova vinaccia si procederà ad una definizione della biodiversità identificando con metodi molecolari le specie presenti, tenendo come riferimento la situazione nota per l'enologia, dove la frazione batterica è ben caratterizzata. Se possibile, verrà effettuato anche un campionamento in un momento successivo all'insilamento, per apprezzare l'effetto selettivo dell'ambiente, senz'altro diverso da quello enologico. Sarà in tal modo possible apprezzare l'evoluzione numerica della popolazione batterica, che nel caso del mosto è fortemente ostacolata dai lieviti, e valutare l'apporto eventuale che questi batteri possono dare in termini di produzione di sostanze indesiderate. 4. Allestimento di esperimenti di insilamento di vinaccia su piccola scala con aggiunta di ceppi di lievito selezionato. In corrispondenza della vendemmia 2004 verranno allestiti due esperimenti in parallelo utilizzando due tipi diversi di vinaccia che saranno messi a disposizione, in base ad accordi già in essere, da due importanti distillerie venete, una in provincia di Treviso (Acquavite S.p.A, Conegliano Veneto) ed una in provincia di Padova (Bonollo Umberto S.p.A., Mestrino). Le vinacce proverranno da uve bianche, per le quali non è prevista la sosta sul mosto (macerazione) e che quindi non subiscono alcuna fermentazione nè trattamento con enzimi pectolitici prima dell'insilamento (vinacce vergini). Verranno utilizzate vinacce di uva Prosecco a Conegliano e di uva Moscato a Padova che si differenziano principalmente per la componente aromatica, più ricca nel secondo caso. Gli esperimenti di insilamento e stoccaggio verranno effettuati in modo strettamente controllato all'interno di cassoni di materiale plastico di dimensioni di circa 1m x 1m x 1m. Ciascun cassone verrà suddiviso internamente in 4 parti per mezzo di paratie, che permetteranno l'effettuazione di 4 campionamenti separati senza disturbare (=arieggiare) la massa rimanente. I prelievi verranno effettuati in momenti determinati, orientativamente individuati come segue: 1. appena completato l'insilamento nei cassoni 2. dopo 1-3 giorni 3. dopo 2-5 giorni 4. dopo 10-20 giorni I momenti verranno definiti con precisione durante l'esperimento, considerando l'andamento climatico, lo stato delle uve ed altre eventuali informazioni che si renderanno disponibili al momento. L'allestimento dei cassoni avverrà in cantina, in modo da lasciar passare il minor tempo possibile dalla pigiatura al trasferimento nei cassoni stessi. Per entrambi i tipi di vinaccia verranno effettuate 4 prove di insilamento, in 4 diversi cassoni, nei quali verranno inoculati ceppi di lievito per favorire e guidare le fermentazioni e studiare l'evolversi della componente aromatica. Per questi esperimenti verranno appositamente selezionati dei ceppi di lievito con caratteristiche ritenute idonee per l'uso sulla vinaccia, a cui verrà affiancato anche un lievito commerciale usato nel settore enologico. In particolare le quattro tesi a confronto saranno le seguenti: 1. Controllo: non verrà addizionato alcun lievito, le fermentazioni saranno condotte dalla microflora indigena. 2. Inoculo con ceppo commerciale di Saccharomyces cerevisiae selezionato per uso enologico. Il ceppo scelto è stato già usato da una delle distillerie citate; per questo ceppo esiste un sistema molecolare rapido di rilevazione, sviluppato dal Dipartimento di Biotecnologie Agrarie di Padova. 3. Inoculo con un ceppo del genere Saccharomyces che verrà selezionato tra quelli isolati dalle vinacce di vendemmie precedenti, possibilmente scelto per la bassa capacità di produrre sostanze tossiche. 4. Un ceppo non-Saccharomyces, scelto sempre tra quelli isolati in precedenza. Questo tipo di lieviti predominano nelle prime fasi della fermentazione e potrebbero perciò essere degli importanti attori nella definizione del profilo aromatico, oltre che intervenire in modo rilevante nella produzione di sostanze tossiche Per i ceppi che verranno usati ai punti 3 e 4 sarà necessario approntare un sistema di rilevamento rapido, che verrà ottenuto seguendo l'approccio già utilizzato per il ceppo usato al punto 2. 5. Monitoraggio delle attività enzimatiche della vinaccia e dei microrganismi (dell'esperimento di cui al punto 4) in relazione alla produzione di metanolo ed etil-carbammato. Eventuale utilizzo di sonde geniche. Ai tempi stabiliti verranno effettuati i campionamenti dai cassoni contenenti la vinaccia per l'ottenimento dei seguenti dati: 1. Stima della popolazione di lieviti vitali, attraverso la crescita in piastra su mezzi di coltura appropriati; 2. Stima della popolazione batterica totale e delle frazioni eventualmente ritenute interessanti; 3. Rilevamento dei ceppi inoculati e valutazione della capacità di prevalenza nei confronti dei ceppi indigeni; 4. Determinazione della quantità di metanolo ed etil-carbammato presente nella massa insilata; 5. Determinazione delle attività enzimatiche di origine vegetale riscontrate nei due tipi diversi di vinaccia; 6. Verrà eseguita una distillazione su piccola scala per la determinazione della presenza di sostanze nocive nel distillato; 7. Monitoraggio della componente fenolica presente nella vinaccia a differenti stadi di conservazione e dopo la sua trasformazione in grappa. Questa parte del programma sarà portata avanti in stretta collaborazione con l'U.O. di Biochimica. Le stesse analisi saranno effettuate anche su altre tiplogie di vinacce ed in diverse condizioni di processo 8. Qualora sia stato possibile (vedi punto 1) sviluppare delle sonde genetiche per l'individuazione delle attività enzimatiche legate alla produzione di metanolo ed etil-carbammato, si utilizzerà questo approccio per uno studio "in situ" del fenomeno.