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Lo scopo della ricerca della UOVT è quello • di studiare in vivo la reazione metabolica di radici di piantine di mais al Cu in presenza nella rizosfera di molecole organiche con diversa attività chelante, seguendo le indicazioni della UOSS; • di determinare la produzione endogena in semenzali di mais di acidi organici in risposta alla presenza nel mezzo esterno di rame a differenti concentrazioni (con differente biodisponibilità ?). La ricerca sarà condotta su semenzali di mais cresciuti in idroponica in condizioni controllate. L'effetto degli acidi organici a basso peso molecolare sulla tossicità di metalli di transizione sarà studiato analizzando i parametri biochimici e fisiologici correlati al danno ossidativo e alla risposta antiossidativa delle radici di mais. Il danno ossidativo verrà studiato in presenza di acidi organici a basso peso molecolare quali l'acido piruvico, l'acido malico, l'acido citrico e l'acido caffeico. L'azione di quest'ultimo sarà studiato sia in presenza che in assenza degli acidi organici piruvico, malico e citrico. Queste prove saranno condotte in stretta collaborazione con l'UOSS. Il danno ossidativo sarà studiato valutando l'inibizione della crescita delle radici primarie e la perossidazione dei lipidi di membrana (test MDA). La risposta antiossidativa sarà analizzato misurando l'attività detossificante di radicali (test RSA) e l'attività di alcuni enzimi antiossidanti come la ascorbato perossidasi, la glutatione reduttasi, la catalasi e la guaiacolo perossidasi. Inoltre, l'effetto degli acidi organici sul passaggio del rame dall'apoplasto al simplasto sarà seguito nel tempo stimando con l'assorbimento atomico il contenuto di Cu nei tessuti delle piantine, sia parte aerea che le radici. L'accumulo di acidi organici nei tessuti delle radici di piante esposte a metalli tossici, quali rame e alluminio sarà stimato mediante cromatografia liquida ad elevate prestazioni (HPLC). Lo studio sarà condotto valutando diversi metodi HPLC per l'identificazione e il dosaggio di acidi organici estratti dalle radici di mais. Saranno principalmente investigati acidi organici a basso peso molecolare, quali l'acido citrico e malico, dei quali è noto il loro coinvolgimento nel trasporto di cationi di specie nutrienti e tossiche. L'identificazione e il dosaggio di questi analiti sarà eseguito mediante HPLC a scambio ionico o a fasi inverse con rilevazione UV indiretta in considerazione del basso assorbimento della luce UV da parte degli acidi organici a basso peso molecolare. Tale approccio richiederà il trattamento preliminare del campione per rimuovere le altre sostanze organiche presenti nell'estratto che potrebbero interferire con la separazione e la rivelazione degli analiti. Questo trattamento preliminare del campione sarà eseguito mediante una procedura di estrazione in fase solida utilizzando cartucce a scambio anionico. L'identificazione dei singoli acidi organici sarà condotta mediante aggiunta dei composti standard al campione, gli stessi utilizzati per determinare le rette di calibrazione per le determinazioni quantitative. Inoltre, in lavori precedenti è stato messo in evidenza che, aumentando il danno ossidativo causato dal rame e le attività enzimatiche correlate alla risposta antiossidativa, le piantine di semenzali di mais hanno aumentato in maniera significativa il contenuto di putrescina e spermina nei tessuti delle radici (Zacchini et al., 2003). Le poliammine sono dei prodotti naturali noti essere nelle piante molto sensibili agli stress causati da diverse condizioni ambientali. Tenendo in considerazione questi risultati, durante il secondo anno del progetto saranno fatte delle analisi su piante che crescono in Piemonte in aree con elevato contenuto di rame in collaborazione con l'UOTO. In particolare saranno raccolti campioni di piante che crescono in campi convertiti da vigne a coltivazioni erbacee, soprattutto mais, e il contenuto di poliammine sarà determinato con l'HPLC a fasi inverse (Zacchini et al., 2003). I risultati dei campioni prelevati in campo potrebbero aiutare a comprendere se queste poliammine (putrescina e spermina) possano essere utilizzate come markers dello stress ossidativo in piante che crescono in aree inquinate.
