RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

IL COLLASSO DELLE CUCURBITACEE IN ITALIA: PATOGENI COINVOLTI E MEZZI DI LOTTA.

Università di riferimento

Università degli Studi "Mediterranea" di REGGIO CALABRIA - AGROCHIMICA E AGROBIOLOGIA - REGGIO CALABRIA(RC)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Vincenzo VACANTE

Descrizione

Gli obiettivi del programma di ricerca di questa Unità di Ricerca (U.R.) sono i seguenti: 1) Determinare la diffusione del “collasso delle cucurbitacee” nel sud-ovest Italia e Sicilia ed isolare ed identificare le specie fungine ad essa associate. A tal fine l’U.R., che ha competenze specialistiche nei settori della Patologia vegetale ed Entomologia agraria delle colture orticole, studierà preliminarmente la complessità biologica dei sistemi ospite-patogeno, allo scopo di mettere in evidenza eventuali interazioni eziologiche ed epidemiologiche fra fattori biotici ed abiotici diversi e fungerà da supporto per le altre UU.RR. impegnate nell’obiettivo, in presenza di aspetti biotici complessi e diversificati. 2) Studiare la struttura genetica delle popolazioni fungine associate al “collasso” allo scopo di definirne la variabilità genetica, l’origine e la specializzazione sull’ospite. La caratterizzazione sarà condotta su un gruppo definito di isolati italiani e esteri con impiego dei seguenti marker genetici: profili elettroforetici di proteine totali ed isoenzimi miceliari e gruppi di compatibilità vegetativa (VCGs). L’elaborazione dei dati sarà realizzata congiuntamente alle altre U.R. impegnate contemporaneamente nella caratterizzazione ecologica (U.R. n.4), patogenetica (U.R. n. 3) e molecolare (U.R. n.1) degli stessi isolati, allo scopo di sviluppare dendrogrammi globali di confronto. 3)Definire la gamma d’ospiti delle principali specie fungine rinvenute associate al “collasso” dalle UU.RR. coinvolte nell’obiettivo 1, mediante indagini di tipo micologico e, a partire dal secondo anno, saggi molecolari (amplificazione genica - PCR) con impiego di primers specifici che saranno testati nel primo anno di attività dall’U.R. n.1. FASI DI SVILUPPO DELLA RICERCA I ANNO Nel corso del primo anno di ricerca, sarà realizzata un’indagine sulla diffusione del “collasso” nell’Italia sud-occidentale ed in Sicilia e curato l’isolamento e l’identificazione delle specie fungine associate. Le osservazioni saranno mirate in particolare ad evidenziare la presenza di interazioni biotiche (funghi, nematodi, insetti, ecc.) ed abiotiche (temperatura, umidità, reazione, salinità del terreno, tecniche colturali, ecc.) di tipo complesso. Saranno avviate inoltre indagini finalizzate alla determinazione della gamma d’ospiti delle specie fungine rinvenute associate al collasso, a fini epidemiologici e per la messa a punto degli interventi di difesa integrati di cui alle attività delle U.R. n.1, 2, 3 e 4. Sarà avviata l’attività di caratterizzazione genetica degli isolati. a) Raccolta di campioni fitopatologici, isolamento e identificazione di specie fungine. Un ampio campione di piante sintomatiche per ciascuna area infetta sarà prelevato ed analizzato in laboratorio. Gli apparati radicali saranno lavati in acqua corrente e gli isolamenti realizzati da frammenti radicali con sintomi di necrosi, suberosi, marciumi, previa disinfezione superficiale per immersione in una soluzione di ipoclorito di sodio e successivo doppio risciacquo in acqua sterile. I frammenti saranno quindi trasferiti su substrato nutritivo agarizzato (agar-acqua, agar-patata-destrosio) addizionato con solfato di streptomicina.(0,5 mg ml -1) e su terreni selettivi per Pythium (PDA addizionato con pimaricina, ampicillina, rifampicina, pentachloronitrobenzene) e Phytophthora (BNPRAH: PDA addizionato con benomyl, nistatina, pentachloronitrobenzene, rifampicina, ampicillina, imexazolo). Le piastre saranno incubate al buio a 25-27 °C e dopo un periodo d’incubazione di 2-5 giorni frammenti miceliari saranno trasferiti su PDA. Le colonie fungine sviluppatisi saranno quindi identificate sulla base delle caratteristiche morfologiche con osservazioni al microscopio ottico. Un periodo di incubazione più lungo sarà necessario per la differenziazione dei periteci in piastra di M. cannonballus (15-20 giorni). In caso di mancata sporulazione le piastre saranno incubate sotto NUV + luce fluorescente con un fotoperiodo di 12 ore. Porzioni di radice saranno inoltre poste in camera umida per favorire lo sviluppo di strutture riproduttive (picnidi, periteci). Saranno rilevati i dati relativi a frequenza di isolamento per ogni specie fungina e per tipologia di tessuto e area geografica d’origine. Sottocolture degli isolati saranno inviate all’U.R. n. 3, dove verranno mantenuti in collezione allo scopo di insediare una micoteca degli isolati italiani e stranieri e selezionare il gruppo di isolati da sottoporre a caratterizzazione congiuntamente da parte delle varie UU.RR.. b) Determinazione della gamma d’ospiti L’indagine sarà condotta con osservazioni a campione su apparati radicali di piante cucurbitacee e non cucurbitacee coltivate in avvicendamento o in prossimità di piante con sintomi di collasso. Per favorire l’evasione dei patogeni saranno realizzate camere umide di frammenti radicali ed in presenza di sintomi (necrosi, suberosi, marciumi, ecc.) isolamenti su substrato nutritivo. Saranno inoltre realizzate prove di inoculazione artificiale con isolati monoascosporici di M. cannonballus su cucurbitacee non ospiti naturali del fungo e su un’ampia gamma di specie erbacee non cucurbitacee coltivate e spontanee, comuni nelle aree di coltivazione delle cucurbitacee, secondo i protocolli definiti dall’U.R. n.3 per le prove di patogenicità. c) Caratterizzazione genetica degli isolati. Sarà avviata la caratterizzazione genetica degli isolati, con riferimento a quelli già disponibili presso le UU.RR. o micoteche italiane ed estere (si veda 2° anno). II Anno Nel corso del secondo anno sarà realizzata la caratterizzazione genetica di un gruppo selezionato di isolati, rinvenuti sul territorio nazionale dalle UU.RR. n. 2, 3, 4 e 5 nel corso del primo anno di attività e depositate presso l’U.R. n.3, in confronto con altri isolati italiani e stranieri. Gli stessi isolati saranno sottoposti a caratterizzazione ecologica, patogenetica e molecolare da parte di altre UU.RR. Sarà inoltre realizzato un ampio screening diagnostico al fine di determinare la gamma d’ospiti mediante amplificazione genica (PCR) con i primers specifici che saranno testati nel primo anno di attività dall’U.R. n.1. a) Caratterizzazione genetica degli isolati. Saranno determinati i profili elettroforetici delle proteine miceliari e degli isoenzimi e i gruppi di compatibilità vegetativa (VCGs). PROFILI ELETTROFORETICI DI PROTEINE TOTALI ED ISOENZIMI Gli isolati saranno allevati in brodo di patata o carota in beute Erlenmeyer ed incubati al buio a 25-27 °C. Dopo 6-10 giorni il micelio sarà recuperato mediante filtrazione su mussolina, lavato con tampone di estrazione (Tris-HCl, 0,5 mM; pH 6,8; EDTA 1mM; DTT 1mM; PMSF 1mM) ed utilizzato immediatamente per l’estrazione delle proteine oppure congelato con azoto liquido e conservato a – 20 °C. Il micelio dopo essere stato omogeneizzato per 6 minuti sarà sottoposto a sonicazione per 4 min. in tampone di estrazione. I frammenti di parete cellulare ed i detriti cellulari saranno eliminati mediante centrifugazione a 40.000 g per 40 min. Tutte le fasi descritte saranno condotte a 4 °C. Al supernatante recuperato dopo centrifugazione viene aggiunto glicerolo (10%) e blu di bromofenolo (0,002%). La concentrazione proteica degli estratti miceliari sarà determinata con il metodo di Bradford (1976). Le proteine solubili del supernatante saranno analizzate su lastre di poliacrilammide con gel di concentrazione e gel di separazione (rispettivamente al 3,5 e 7,5% di acrilammide) in un sistema tampone non dissociante e con voltaggio costante. Al supernatante recuperato dopo centrifugazione sarà aggiunto glicerolo (10%) e blu di bromofenolo (0,002%). I gel saranno colorati con blu di Coomassie (metanolo 50%, acido acetico 7,5%, blu di Coomassie 0,2%) per evidenziare il profilo delle proteine totali e con procedimenti di colorazione specifici per l’attività degli isoenzimi (esterasi, fosfatasi acida, glucosio deidrogenasi, ecc.). La distanza genetica tra gli isolati sarà determinata confrontando tra loro i profili elettroforetici e calcolando il valore dell’indice di similitudine. GRUPPI DI COMPATIBILITA' VEGETATIVA I Gruppi di compatibilità vegetativa (VCGs) saranno determinati sulla base della capacità di mutanti auxotrofici non utilizzatori di nitrato (nit) di formare eterocarion in colture binate, con produzione di micelio prototrofo. Substrati di coltura: -PDA: Agar – patata - destrosio. - BM: saccarosio 30 g, KH2PO4 1 g, MgSO4×7 H2O 0,5 g, KCl 0,5 g, FeSO4×7 H2O 0,01 g, soluzione di microelementi 0,2 ml, agar 20 g, acqua distillata 1 l. - MM: BM + NaNO3 2 g l-¹ . - MMC: MM + asparagina 1,6 g l-¹ + KClO3 (10, 15 o 20 g l-¹). - PDC: PDA + KClO3 (10, 15 o 20 g l-¹). Selezione di mutanti nit: La selezione dei mutanti nit sarà realizzata su substrato nutritivo addizionato con clorato di potassio (MMC o PDC) a partire da isolati selvatici in attivo accrescimento su PDA. Per isolati meno sensibili al clorato potranno essere utilizzate dosi di clorato crescenti (30, 40, 50 e 60 g l-¹). I settori a rapido accrescimento, che compariranno dopo un periodo variabile di incubazione, saranno considerati mutanti nit se formeranno colonie trasparenti con micelio radente su MM e colonie di tipo selvatico con micelio aereo su PDA. Classificazione fenotipica dei mutanti nit: Per ciascuna specie fungina sarà valutata la capacità a differenziare mutanti in relazione al fenotipo ed alla concentrazione di clorato. La caratterizzazione fenotipica dei mutanti sarà effettuata sulla base dei fenotipi fisiologici individuati attraverso l’analisi del controllo genetico dell’assimilazione dei nitrati in Aspergillus nidulans e Neurospora crassa, simile a quello di specie fitopatogene (Fusarium spp., Colletotrichum spp., ecc.). I mutanti saranno fatti sviluppare su substrato minimo (MM) e su substrato basale (BM) addizionato con fonti diverse di azoto: nitrito di sodio (NaNO2), 0,5 g l-¹; ipoxantina, 0,2 g l-¹; tartrato d’ammonio, 1 g l-¹; acido urico, 0,2 g l-¹. Il fenotipo (nit 1, nit 3, nit M) sarà determinato sulla base del tipo di sviluppo, selvatico o rado, del micelio sui differenti substrati. Determinazione della compatibilità vegetativa: I mutanti nit fenotipicamente diversi saranno appaiati in tutte le possibili combinazioni, ponendo tasselli di micelio in piastre Petri su MM, a distanza di 1-2 cm tra di loro, secondo la procedura descritta da Puhalla (1985). Due isolati saranno considerati vegetativamente compatibili se si osserva la formazione di micelio aereo (prototrofo) lungo la linea di contatto tra i miceli di due mutanti complementari. b)Determinazione della gamma d’ospiti Sarà realizzato un ampio screening della gamma d’ospiti, su specie cucurbitacee e non cucurbitacee, mediante diagnosi molecolare con amplificazione genica (PCR) utilizzando i primers specifici testati, nel primo anno di attività, dall’U.R. n.1.