Bibliografia
Atala and Lanza, Methods of Tissue Engineering, Academic Press; 1st edition (October 2001).
Caliceti P. , S. Salmaso, N. Elvassore, A. Bertucco, “Effective protein release from PEG/PLA nano-particles produced by compressed gas anti-solvent precipitation techniques”, submitted to J. Control. Release 94(1), 195-205 (2004).
Chen G. , T. Ushida and T. Tateishi, Scaffold design for tissue engineering. Macromolecular Biosciences 2 2 (2002), pp. 67–77.
Desai Tejal A. , Micro- and nanoscale structures for tissue engineering constructs, Medical Engineering & Physics, 22, 595–606, 2000
Dillow A.K. , F. Dehghani, J.S. Hrkach, N.R. Foster and R. Langer, Bacterial inactivation by using near- and supercritical carbon dioxide. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (1999), pp. 10344–10348.
Dillow and Lowman, Biomimetic Material and Design Marcel Dekker, New York, USA (2002)
Elvassore N. , A. Bertucco, & P. Caliceti, J. Pharm. Sci., 90(10), 1628-1636 (2001).
Elvassore N. , M. Baggio, et al., Biotechnoogy & Bioengineering, 73(6), 449-457 (2001).
Freed Lisa E. , Gordana Vunjak-Novakovic, Culture of organized cell communities, Advanced Drug Delivery Reviews, 33, 15-30, 1998
Fuchs J.R. , M.D. Boris et al., CCCETS Basic Science Lecture, Ann. Thorac Surg, 2001; 72:577-91
Lanza Robert P., Robert Langer, William L. Chick, Principles of Tissue Engineering, Academic Press; (January 1997).
Leong K.F. , C.M. Cheah and C.K. Chua, Biomaterials, 24, 2363-2378, 2003
Lina A.S.P. , T.H. Barrows et al., Microarchitectural and mechanical characterization of oriented porous polymer scaffolds, Biomaterials, 24, 481–489, 2003
Martin Ivan , David Wendt and Michael HebererThe role of bioreactors in tissue engineering, Trends in Biotechnology, Volume 22, Issue 2, February 2004, Pages 80-86
Quirk Robin A. , Richard M. France , Kevin M. Shakesheff and Steven M. Howdle, Supercritical fluid technologies and tissue engineering scaffolds, Current Opinion in Solid State and Materials Science, In Press, Corrected Proof, Available online 18 March 2004.
Seal B.L. , T.C. Otero, A. Panitch, rewiew Polymeric biomaterials for tissue and organ regeneration, Materials science and Engineering R, 34, 147-230, 2001
Shin H., Seongbong Jo and Antonios G. Mikos, Biomimetic materials for tissue engineering, Biomaterials, Volume 24, Issue 24, November 2003, Pages 4353-4364
Sohier J. , R.E. Haan et al, A novel method to obtain protein release from porous polymer scaffolds: emulsion coating, Journal of Controlled Release, 87, 57–68, 2003
Sproule Taryn L. , J. Alex Lee, Hongbo Li, John J. Lannutti and David L. Tomasko, Bioactive polymer surfaces via supercritical fluids, The Journal of Supercritical Fluids, Volume 28, Issues 2-3, March 2004, Pages 241-248
Striolo, T. Parton, N. Elvassore, A. Bertucco, “Volume Expansion and Solvent-Power Changes in GAS Anti-Solvent Processes: an Experimental Investigation on Polymer Precipitation”, AIChE J. 49(10), 2671-2679 (2003).
Tabada Y. , Reviews Research Focus, DDT, 6, 483-487, 2001.
TabataY. , Reviews Research Focus, PSTT 3, 80-90, 2000
Takezawa Toshiaki A strategy for the development of tissue engineering scaffolds that regulate cell behavior, Biomaterials, Volume 24, Issue 13, June 2003, Pages 2267-2275 .
Vezzu’ K. , N. Elvassore, Bioactive surface of polymeric scaffolds by gas media, 2nd Annual Meeting of European Tissue Engineering Society, Genova 2003, September 3rd – 6th.
Vozzi G. , C. Flaim et al., Biomaterials, 24, 2533-2540, 2003
Vozzi G., Christopher J. Flaim, Francesca Bianchi, Arti Ahluwalia and Sangeeta Bhatia Materials Science and Engineering: C, Volume 20, Issues 1-2, 31 May 2002, Pages 43-47.
Obiettivi generali. Il progetto di ricerca si propone di mettere a punto una nuova metodologia per la produzione di scaffolds polimerici biodegradabili micro e nano-strutturati con proprietà biomimetiche. Si intende, quindi, assorbire sulla superficie dello scaffolds od inglobare nella matrice polimerica molecole bioattive in grado di controllare e regolare l'attività cellulare. La metodologia dovrà ricoprire l'intero processo produttivo che va dalla scelta del polimero, alla produzione e funzionalizzazione dello scaffolds polimerico micro e nano-strutturato, fino alla verifica finale del prodotto mediante colture cellulari in bioreattore. Obiettivi specifici Gli obiettivi specifici del progetto sono riassunti nei seguenti punti: - Allestire un laboratorio per la produzione delle strutture polimeriche bidimensionali mediante tecnica litografica con una accurata risoluzione su scala micrometrica; - Allestire un laboratorio per la produzione di scaffolds tridimensionali mediante le tecnica di salt etching; - Progettare, allestire ed ottimizzare un impianto per la produzione di scaffolds tridimensionali e bidimensionali combinando la tecnica di precipitazione mediante antisolvente gassoso con quella litografica e di salt etching; - Produrre scaffolds polimerici biodegradabili con la desiderata micro e nano-architettura; - Mettere a punto la tecnica di funzionalizzazione della superficie e della matrice dello scaffolds mediante l'uso di gas ad alta pressione; - Progettare ed allestire un bioreattore per la coltura di cellule sugli scaffolds polimerici per la valutazione dell'effettiva qualità dei prodotti ottenuti. Descrizione dettagliata del programma di ricerca Il progetto di ricerca si articola nei seguenti punti: A) Produzione degli scaffolds polimerici biodegradabili micro e nano-strutturati; B) Funzionalizzazione degli scaffolds polimerici: superfici bioattive e rilascio controllato di fattori della crescita; C) Coltura di cellule in vitro su scaffolds: progettazione, allestimento e ottimizzazione di un bioreattore e valutazione della qualità degli scaffolds prodotti; A) Produzione degli scaffolds polimerici biodegradabili micro e nano-strutturati. In questa fase verranno prodotti scaffolds bidimensionali e tridimensionali costituiti da polimeri biodegradabili e bioriassorbibili. In particolare verranno usati tre polimeri ammessi all'utilizzo clinico dalla Food and Drug Administrator (FDA) quali l'acido polilattico, un co-polimero dell'acido lattico e glicolico e l'estere benzilico dell'acido ialuronico. Quest'ultimo verrà fornito dalla Fidia Advanced Biopolymer srl (FAB), un'industria farmaceutica che opera nell'ambito dell'ingegneria dei tessuti. Gli scaffolds bidimensionali verranno prodotti mediante tecnica litografica unita al processo di precipitazione con antisolvente gassoso. Brevemente, verranno prodotte stampi in silicone con micro-architettura bidimensionale di spessore variabile tra 10 e 200 micron mediante la tecnica litografica descritta da Vozzi et al. (2002). Successivamente, verrà indotta la precipitazione del polimero nella soluzione polimerica depositata sullo stampo mediante l'uso di un antisolvente gassoso sotto pressione. Questo processo sarà portato a termine in un impianto di precipitazione opportunamente modificato disponibile presso il laboratorio alta pressione del Dipartimento di Impianti Chimici dell'Università di Padova. Come risultato finale ci si aspetta di ottenere una membrana con una geometria micrometrica impressa dallo stampo in silicone e una nano-porosità determinata dalle condizioni operative (temperatura, pressione e concentrazione polimerica) usate nel processo di precipitazione ad alta pressione. Le membrane potranno essere unite fra loro per formare strutture tridimensionali. Analogamente verranno prodotte delle strutture polimeriche tridimensionali combinando la tecnica salt etching con la precipitazione mediante antisolvente gassoso. In questa nuova tecnica, dei campioni di soluzione organica contenente un polimero e cristalli di sale saranno esposti all'azione dell'antisolvente gassoso. L'antisolvente verrà utilizzato prima per precipitare il polimero e successivamente per rimuovere completamente il solvente organico. Lo scaffolds così ottenuto verrà liberato dalla presenza del sale mediante lavaggio in acqua. Verranno prodotte strutture spugnose che presenteranno una porosità controllata a livello sia micrometrico, determinata dalla granulometria e dalla concentrazione dei cristalli di sale, sia nanometrico, determinata dalle condizioni operative del processo di precipitazione con antisolvente gassoso. Sarà oggetto di studio la co-precipitazione di polimeri idrofilici (per esempio polietilenglicole) e idrofobici (per esempio acido polilattico). Questa procedura consentirà di controllare la degradazione della matrice polimerica e conseguentemente il rilascio di principi attivi come dimostrato in un recente lavoro (Elvassore et al., 2001, Caliceti et al., 2004). I prodotti ottenuti verranno analizzati attraverso analisi microscopiche (SEM, ESEM, TEM).altri studi di caratterizzazione potranno riguardare la bagnabilità mediante la determinazione dell'angolo di contatto. B) Funzionalizzazione degli scaffolds polimerici: superfici bioattive e rilascio controllato di fattori della crescita. Questa fase della sperimentazione che rappresenta una delle innovazioni scientifiche più interessanti dell'intero progetto di ricerca, verrà progettata ed eseguita in collaborazione con le altre unità operative. Sarà sviluppata una tecnica originale per la deposizione e l'inglobamento di sostanze bioattive nello scaffold mediante l'impiego di gas ad alta pressione a temperatura. Una procedura simile è stata recentemente applicata da Sproule et al. (2004) per assorbire un principio attivo in film di polimetilmetacrilato. In questo progetto si propongono alcune modifiche a questa tecnica che consentiranno di avere uno strumento versatile in grado di depositare sulla superficie (adsorbimento) o assorbire all'interno della matrice polimerica fattori della crescita (Vezzu e Elvassore, 2003). Questo processo potrà operare a temperatura ambiente preservando la bio-attivita di molecole tremolabili. In particolare, uno scaffolds polimerico tridimensionale viene posto in contatto con un soluzione contenente il principio attivo che deve essere depositato o assorbito. Il sistema viene pressurizzato con un gas in modo da ottenere due effetti: la plasticizzazione del polimero e la variazione delle condizioni termodinamiche del soluto in soluzione per mezzo del gas. In particolare, il gas penetrando nel polimero lo rigonfia favorendo l'adsorbimento e assorbimento delle biomolecole in soluzione. Nello stesso tempo, il gas solubile nella soluzione si comporta da antisolvente, riducendo la solubilità del soluto e inducendone la precipitazione. Si prevede di usare l'anidride carbonica come agente gassoso in quanto è solubile nei polimeri citati sopra e si comporta come antisolvente nelle soluzioni impregnanti (Striolo et al., 2003). Sarà fondamentale comprendere il comportamento termodinamico dei soluti in presenza del gas antisolvente. Si ritiene importante sottolineare che l'uso di gas ad alta pressione consente anche di ottenere la sterilizzazione dello scaffolds (Dillow et al., 1999) e l'estrazione di eventuali residui di solventi organici ed eventuali impurezze presenti nella matrice polimerica. Inoltre, sarà interesse di questo progetto inglobare all'interno delle strutture polimeriche micro e nano-particelle per rilascio controllato di molecole bio-attive. Le particelle potranno essere inglobate sia durante la fase di produzione dello scaffolds (Punto A) sia durante il successivo processo di funzionalizzatione (Punto B) . Questo procedura consentirà di produrre scaffolds con un rilascio simultaneo e differenziato di più principi attivi. Saranno eseguite analisi quantitativa per valutare il grado di caricamento e la distribuzione del principio biologicamente attivo e la stabilità nel tempo del principio e del prodotto. C) Coltura di cellule in vitro su scaffolds: progettazione, allestimento e ottimizzazione di un bioreattore e valutazione della qualità degli scaffolds prodotti. Il bioreattore è un vero e proprio simulatore di organismo vivente nel quale vengono riprodotti stimoli biochimici e biomeccanici dell'organismo. E' un'apparecchiature sterilizzabile, dotata di un accurato controllo di temperatura, pressione, pH, di concentrazione di metaboliti, di prodotti del metabolismo cellulare e di gas. In aggiunta, il bioreattore può essere usato per riprodurre condizioni di stress idrodinamico mediante la variazione della portata del mezzo di coltura attraverso lo scaffolds. Questo stimolo è anche un parametro fondamentale per avere una distribuzione uniforme di gas e metabolici all'interno della struttura spugnosa. In letteratura sono riportati numerosi modelli di reattore con diverse configurazione (Martin et al., 2004). Il reattore a perfusione è l'unico che garantisce una uniforme distribuzione di nutrienti alle cellule in colture su larga scala grazie all'instaurarsi di un regime convettivo e diffusivo di trasporto di materia anche all'interno dello scaffolds. Il bioreattore sarà costituito da una camera di coltura che conterrà lo scaffolds polimerico e sarà dotato dei servizi ausiliari necessari al mantenimento dell'attività cellulare. Si prevede un controllo di temperatura mediante bagno termostatico esterno. Il mezzo di coltura sarà ricircolato in modo continuo mediante pompe peristaltiche. Si prevede di dotare il bioreattore di una unità di scambio di gas per garantire l'apporto di ossigeno ed eliminare anidride carbonica. Le pressioni parziali dei gas saranno mantenute costanti prelevando l'aria da un incubatore a CO2 mediante pompa peristaltica. Le analisi microscopiche, istologiche e immunoistochimiche delle colture cellulari e l'approvvigionamento di cellule verrà garantito dal gruppo di ricerca del laboratorio Tissue Tech del Dipartimento di Istologia, Microbiologia e Biotecnologie Mediche del'Università di Padova con il quale è in atto una collaborazione sullo sviluppo di bioreattori per colture cellulari di fibroblasti. Piano di sviluppo della ricerca Si riporta un piano dettagliato della ricerca diviso in semestri. Primo anno, I semestre - Allestimento laboratorio per la produzione degli scaffolds polimerici bidimensionali; - Definizione delle caratteristiche geometriche degli scaffolds; - Produzione scaffolds bidimensionali; - Allestimento laboratorio per produzione di scaffolds tridimensionali; - Produzione scaffolds tridimensionali. Primo anno, II semestre - Allestimento laboratorio per funzionalizzazione scaffolds; - Funzionalizzazione degli scaffolds con promotori di adesione e fattori di crescita; - Valutazione dell'adsorbimento e assorbimento dei fattori di crescita; - Valutazione dell'adesione e della proliferazione cellulare in vitro; - Progettazione del bioreattore. Secondo anno, I semestre - Allestimento, collaudo ed ottimizzazione del bioreattore per la coltura di fibroblasti; - Produzione scaffolds tridimensionali funzionalizzati con fattori di adesione e di crescita cellulare; - Prove di coltura di cellule, fibroblasti, sugli scaffolds funzionalizzati in bioreattore. Secondo anno, II semestre - Ottimizzazione del bioreattore per la coltura di fibroblasti; - Messa a punto del processo di maturazione tessuti nel bioreattore; - Analisi dell'influenza del flusso di permeato attraverso lo scaffolds sulla crescita cellulare; - Definizione dei criteri per la progettazione di scaffolds adeguati (micro- e nano-porosità) per colture cellulari. Risultati attesi. Risultati attesi alla fine del primo anno: - Allestimento il laboratorio per la produzione degli scaffolds polimerici; - Produzione scaffolds con desiderate caratteristiche geometriche; - Allestimento laboratorio per funzianalizzazione scaffolds; Alla fine del progetto di ricerca si prevede di raggiungere i seguenti risultati: - Produzione di scaffolds bio-mimetici funzionalizzati con fattori di adesione e fattori di crescita; - Progettazione, allestimento, collaudo e ottimizzazione del bioreattore per colture cellulari su scaffolds polimerici; - Messa a punto della procedura di valutazione degli scaffolds da impiegare nella rigenerazione di tessuti in bioreattore mediante esperimenti in vitro nel bioreattore; I risultati del progetto saranno verificabili attraverso tesi di laurea, note tecniche, presentazione a congressi e pubblicazioni scientifiche su riviste nazionali e internazionali Valutazione del rischio Si ritiene che il rischio di insuccesso in relazione ai risultati dichiarati sia molto basso. Molte metodologie adottate per l'intero processo di produzione degli scaffold biomimetici micro e nano-strutturati sono dettagliatamente riportate in letteratura. Per quanto concerne gli aspetti più innovativi, si è voluto eseguire un breve studio di fattibilità prima di proporre il progetto di ricerca. In particolare, per la tecnica di funzionalizzazione sono stati presentati risultati preliminari al congresso europeo di ingegneria tessutale a settembre 2003 (Vezzu and Elvassore, 2003). Ambito collaborativo e competenze. L'attività del gruppo di Ingegneria Chimica, attualmente formato da un ricercatore, da un professore ordinario, da tre dottorandi, e un assegnista di ricerca opera da circa cinque anni a livello internazionale nello sviluppo di materiali e processi per applicazioni farmaceutiche e bio-mediche. Per la fornitura e l'utilizzo dell'acido ialuronico e dei suoi derivati, ci si avvale della collaborazione della FAB, un industria farmaceutica particolarmente interessata nello sviluppo di metodologie per la produzione di scaffolds tridimensionali micro e nano-strutturati. La FAB è da anni impegnata nella ricerca e sviluppo di tessuti ingegnerizzati con particolare riferimento alla produzione in vitro di derma e cartilagine. Dopo una prima fase del progetto i cui si intende valutare la fattibilità delle metodologia proposte per la produzione di scaffolds in acido ialuronico, la FAB ha manifestato l'interesse di partecipare al co-finanziamento del presente progetto di ricerca. L'attività di ricerca legata alle problematiche istologiche sarà svolta dal laboratorio TissueTech della sezione Istologica del Dipartimento di Istologia, Microbiologia e Biotecnologie Mediche. Il laboratorio TissueTech, guidato dal Prof. Abatangelo, è da molti anni impiegato a livello internazionale nella ricostruzioni in vitro di tessuti quali, derma, cartilagine ed epiteliali. Per lo sviluppo del presente progetto verranno inoltre richieste delle borse di studio, per un totale di 24 mensilità, che saranno attribuite a neolaureati che avranno maturato una specifica conoscenza nell'ambito di ricerca durante il loro impegno di tesi. Il lavoro di ricerca verrà coadiuvato dalla partecipazione di laureandi in Ingegneria Chimica, Biologia, Biotecnologie e Medicina.
