RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Riutilizzo e smaltimento eco-compatibile dei reflui dell'industria agro-alimentare con recupero e bioconversione delle sostanze antiossidanti

Università di riferimento

Università degli Studi de L'AQUILA - CHIMICA, INGEGNERIA CHIMICA E MATERIALI - L'AQUILA(AQ)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Maria CANTARELLA

Descrizione

EFFETTO DI COMPOSTI FENOLICI SULLA DEGRADAZIONE ENZIMATICA DELLA FRAZIONE ORGANICA DI ACQUE DI VEGETAZIONE (ARF). STUDIO CINETICO IN MEZZI E REATTORI INGEGNERIZZATI. L'attività di ricerca del gruppo dell'Università di L'Aquila è volta al seguente studio: la riduzione dell'impatto ambientale di acque reflue di frantoio (ARF) generate durante la produzione di olio di oliva. La composizione chimica media del refluo è acqua (83.4%), materia organica (14.8%) con 1-1.5% of poli-fenoli e sali minerali (1.8%) (Pozo et al., 2002). Questi reflui contengono anche consistenti frazioni cellulosiche e pectiche la cui degradazione catalizzata da enzimi in mezzi non convenzionali fornirebbe una fonte di carbonio capace di sostenere la crescita microbica nel successivo trattamento del refluo. L'impiego di enzimi consentirebbe di ridurre i solidi sospesi migliorando così la reologia dell'intero sistema. Le risultanze della ricerca contribuiranno ad ampliare le conoscenze di base e a definire nuove strategie per il trattamento biologico di reflui recalcitranti (non-biodegradabili negli impianti convenzionali). La degradazione enzimatica della cellulosa contenuta in questi reflui può essere anche realizzata in presenza di solventi organici non miscibili in acqua. L'impiego di questi mezzi non convenzionali potrebbe garantire la rimozione dalla fase acquosa, dove l'enzima di preferenza opera, di sostanze tossiche e/o inibitorie. Risultati incoraggianti sono già stati ottenuti nel corso di studi preliminari dimostranti la possibilità concreta di generare glucosio a partire dalla cellulosa in questi reflui complessi (Fedele, 2003). Inoltre, molte similarità sussistono tra le tecniche sperimentali, i metodi analitici e la caratterizzazione dei bioprocessi per la degradazione dei due biopolimeri. D'altra parte, l'unità di ricerca della Università di L'Aquila possiede elevata esperienza in questo genere di studi anche se applicati a settori diversi quali la produzione di oligomeri ad elevato valore aggiunto dalla degradazione della pectina e la produzione di etanolo da idrolizzati enzimatici di cellulosa a partire da materiale lingocellulosico pretrattato in impianti di steam-explosion e detossificato. Il progetto di ricerca sulla idrolisi dei biopolimeri contenuti nelle ARF riguarderà sia gli aspetti sperimentali che le simulazioni teoriche e si articolerà in un programma ripartito su due anni. Sono previste durante l'intero periodo di svolgimento del programma delle forti interazioni con tutte le unità partecipanti al progetto. PRIMO ANNO - EFFETTO DEI COMPOSTI FENOLICI SULLA CINETICA ENZIMATICA Il primo anno sarà dedicato allo studio dell'effetto dei diversi composti fenolici, in mezzo di reazione modello, sulla cinetica di ciascuna reazione coinvolta nella biodegradazione. Impiegando l'opportuno substrato sarà possibile studiare gli effetti di inibizione e la cinetica di disattivazione di ciascuna componente enzimatica del complesso impiegato (cellulosico o pectinasico). A. MESSA A PUNTO DELLE TECNICHE ANALITICHE All'uopo la prima parte della investigazione sperimentale sarà volta a studiare le opportune modifiche da apportare alle determinazioni analitiche per saggiare gli oligosaccaridi in presenza di sostanze organiche. Particolare attenzione sarà dedicata ad accertare la possibile interferenza causata dai composti organici impiegati sia su dosaggi chimici e/o enzimatici degli oligomeri, sia sulla determinazione dei gruppi riducenti, sia sulla valutazione della crescita microbica in un bioprocesso modello opportunamente scelto. Verranno anche ricercate le appropriate condizioni di diluizione compatibili con la sensibilità dei metodi analitici. B. STUDIO DEI PARAMETRI CHE INFLUENZANO LA CINETICA DI IDROLISI DI SUBSTRATI MODELLO IN PRESENZA DI COMPOSTI ORGANICI Successivamente lo studio sarà ampliato al fine di individuare le condizioni sperimentali adottabili per realizzare la biotrasformazione della cellulosa in sistemi aventi composizione chimica prossima a quella delle acque reflue da frantoio. Si determinerà la cinetica di idrolisi in presenza di composti fenolici quali: vanillina, p-idrossibenzaldeide, acido p-idrossibenzoico, acido vanillico, acido cumarico, siringaldeide ed altri ancora. La presenza di queste sostanze è stata accertata nelle acque reflue provenienti dai processi di estrazione dell'olio di oliva, le cosiddette acque di vegetazione (Ramos-Cormenzana et al., 1996), ed esse verranno impiegate sia separatamente che in miscela nel mezzo ingegnerizzato simulante ARF. Si farà uso di enzimi commercialmente disponibili, complessi cellulosici ed enzimi degradanti la pectina, nonché substrati artificiali e naturali (cellulosa cristallina ed amorfa acidi poligalatturonici e pectina). Gli effetti inibenti dei composti rilasciati nelle ARF saranno indagati a differenti livelli di concentrazione dato che gli inibitori possono influenzare sia gli enzimi durante lo stadio di idrolisi che ridurre la velocità di assimilazione dei monomeri durante la crescita microbica. L'intervallo di concentrazione che verrà indagato per queste sostanze andrà da concentrazioni diluite a quelle presenti nelle ARF. Verrà anche verificata la possibilità di sviluppare possibili applicazioni con slurry concentrati nonché di identificare la diluizione minima che consente di ridurre la tossicità preservando al contempo l'attività enzimatica. D'altro canto la rimozione enzimatica dei poli-fenoli, indagata da altre unità di ricerca del progetto coordinato, potrebbe generare delle ARF modificate nelle quali la rimozione selettiva di ulteriori composti ossidanti potrebbe garantire una maggiore velocità di idrolisi enzimatica (Aggelis et al., 2003, Garcia Garcia et al., 2000). L'elevato livello di interazione fra le differenti unità assicurerà una efficiente comparazione dei risultati che porterà ad indirizzare il prosieguo delle ricerche. Il comportamento cinetico delle componenti enzimatiche sarà studiato sia in reattori batch che continui. Dalla integrazione dei risultati ottenuti con queste due configurazioni reattoristiche sarà possibile ipotizzare più fondatamente un meccanismo cinetico e stimare la dipendenza di opportuni parametri cinetici dalla concentrazione dei composti inibitori. Attenzione verrà posta anche alla stabilità enzimatica in modo da valutare la fattibilità di processi di lunga durata su scala reale. Per quanto attiene l'idrolisi della cellulosa, verrà studiata la resa di saccarificazione ad unità monometriche o oligosaccaridi non più riconosciuti come substrati dall'enzima. La temperatura standard sarà quella ottimale per le cellulasi (45 °C) ed il mezzo di reazione sarà sia tamponato, a pH 4.8, sia puramente acquoso. Per raggiungere questi obiettivi verranno impiegate miscele equiponderali di due preparazioni enzimatiche commerciali (Novozym® e Celluclast®), e l'aggiunta di Novozym® servirà a bilanciare la scarsa attività cellobiasica del Celluclast®. Infatti la presenza di beta-glucosidasi esalta l'azione delle altre componenti enzimatiche mantenendo la concentrazione di cellobiosio ad disotto dei livelli inibitori (Alfani et al., 1987); è stato peraltro anche dimostrato il sinergismo incrociato fra cellulasi provenienti da diverse fonti. In una prima fase l'effetto di tossicità dei composti sarà studiato sulle componenti cellulosiche impegnate nell'idrolisi di substrati modello ed anche su un processo aerobico o anaerobico. Interazione con l'unità di Cagliari. Questa prima parte di investigazione prevederà esperimenti condotti in reattori continui ed agitati su scala di laboratorio (volume massimo 50 ml). Verranno eventualmente impiegati anche piccoli reattori a membrana ultrafiltrante per determinare la stabilità operazionale dell'enzima in presenza di selezionati inibitori (Alfani et al., 1983, 1990). Interazione con l'unità di Cosenza e di Napoli. In questa prima fase del progetto di ricerca lo studio rivolto alla degradazione della pectina sarà condotto impiegando, quale substrato, l'acido poli-galatturonico. Ciò si rende necessario a causa del troppo complesso meccanismo di idrolisi della pectina nativa. L'acido poli-galatturonico ha una struttura molto simile a quella della pectina ma manca delle regioni molto ramificate (hairy). Sono previsti delle interazioni (scambi di informazioni e materiale) con le Unità di Cagliari-Trieste e Milano per gli aspetti microbiologici, con Genova per le reazioni parallele e con Cosenza e Napoli per il trattamento dei polifenoli. Le condizioni di reazioni standard saranno concordate con gli altri partners C. EFFETTO DEI MEZZI DI REAZIONE BIFASICI A causa della cattiva reologia dei mezzi di idrolisi contenenti elevate concentrazioni di biopolimeri (100 g/L) parte degli studi saranno condotti in mezzi bifasici impiegando solventi organici immiscibili. Questa unità di ricerca ha in passato studiato l'idrolisi dei biopolimeri in mezzi bifasici. L'impiego di una fase organica può migliorare le rese di idrolisi attraverso una favorevole partizione dei fenoli tra le fasi. Verranno impiegate allo scopo diversi esteri dell'acido acetico (Cantarella et al., 1990, 1992, 2001). Le loro differenti polarità ed altri parametri fisici si sono dimostrati importanti effettori della stabilità e della attività degli enzimi. Un altro parametro investigato sarà il rapporto volumetrico tra fase acquosa ed organica. La partizione fisica dei fenoli sarà studiata indipendentemente in modo da determinare la concentrazione residua nella fase acquosa mettendo questa in relazione con la cinetica di biotrasformazione. SECONDO ANNO - ARF DETOSSIFICATE Nel secondo anno la biodegradazione sarà realizzata in acque reflue di frantoio differentemente detossificate risultanti anche dal lavoro di ricerca delle altre unità del progetto. L'effettiva fattibilità del processo sarà valutata attraverso l'impiego di test fermentativi standard delle correnti zuccherine. A. INVESTIGAZIONE CINETICA IN PRESENZA DI ARF DETOSSIFICATE La seconda fase della ricerca sarà principalmente rivolta all'idrolisi della frazione organica contenuta in ARF opportunamente detossificata. Le condizioni che verranno esplorate riguarderanno. Tempo di reazione, temperatura, eventualmente rapporto ponderale delle due preparazione enzimatiche Novozym® e Celluclast®; concentrazione enzimatica; mezzo di reazione tamponato o puramente acquoso; modalità di rimpiazzo della cellulosa con i carboidrati presenti nelle ARF. L'azione individuale o sinergistica dei componenti sarà anche investigata al fine di accertare se la rimozione selettiva di alcuni composti può rendere fermentabile l'idrolizzato e anche di ottenere informazioni utili per un eventuale progetto del processo di detossificazione. D'altra parte è concretamente possibile che sostanze non deprimenti l'attività enzimatica durante lo stadio di idrolisi possono risultare tossiche per i microrganismi impiegati nel processo. Ad esempio gli acidi formico e levulinico, generati durante la Steam-explosion di biomasse lignocellulosiche e risultati inefficaci nello stadio di idrolisi, erano invece tossici per il lievito Saccharomyces cerevisiae durante la fermentazione poiché riducevano drasticamente la produzione di etanolo di un fattore rispettivamente del 48% e 38% (Cantarella et al., 2004). Interazioni con l'Unità di Napoli per le ARF detossificate e con Genova per le reazioni parallele. B. MODELLAZIONE Per quanto attiene lo studio modellistico della biodegradazione in mezzi ingegnerizzati, le curve descriventi l'andamento della concentrazione nel tempo saranno correlate ai modelli cinetici di letteratura. I parametri verranno messi in relazione alla composizione del mezzo di reazione in modo da definire i criteri per la selezione della composizione ottimale. Questi modelli generalmente descrivono la degradazione dei biopolimeri in sistemi discontinui e conseguentemente un'altra parte dello studio sarà volta a sviluppare modelli basati su assunzioni simili ma descriventi la biodegradazione in un processo continuo. Particolare attenzione verrà riservata a mettere in relazione l'evoluzione temporale della distribuzione dei pesi molecolari con i principali parametri operazionali di processo quali temperatura, rapporto enzima substrato, tempo medio di residenza nel reattore. Infatti i prodotti a relativamente basso peso molecolare rivestono grande importanza e la loro produzione giustificherebbe l'utilizzo di un trattamento "end-of-pipe" a monte di un impianto di trattamento convenzionale. Gli oligosaccaridi prodotti potrebbero essere utilizzati dagli enzimi intracellulari dei microrganismi operanti negli impianti convenzionali. I modelli reperibili in letteratura e sviluppati per i mezzi acquosi quali quelli di Ohmine e Carbonell saranno valutati anche in mezzi non convenzionali e le opportune modifiche alle equazioni saranno realizzate di conseguenza. Uno studio preliminare incoraggia il proseguimento delle ricerche (Marucci, 2003). Forte interazione l'unità di Napoli e Cosenza per gli aspetti modellistici. C. VALUTAZIONE DELLE PRESTAZIONI IN DIFFERENTI CONFIGURAZIONI REATTORISTICHE L'ultima parte del secondo anno verrà dedicata al raffronto dei risultati ottenuti al fine di scegliere le migliori condizioni operazionali per condurre il trattamento "end-of-pipe". Queste condizioni verranno adottate in reattori sia continui che discontinui a scala maggiore rispetto a quella impiegata per le indagini squisitamente cinetiche. Verranno in particolare valutate le prestazioni in termini di produttività, stabilità e durabilità in prospettiva di un sviluppo di processo a scala industriale. In questa ultima fase verranno ulteriormente rafforzate le interazioni e lo scambio di informazioni tra tutte le unità di ricerca afferenti al progetto.