RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

APPROCCIO TEORICO-SPERIMENTALE AGLI STATI NON-NATIVI DELLE PROTEINE: FORMAZIONE DI FIBRILLE AMILOIDI, PROTEINE DISORDINATE E DENATURATE

Università di riferimento

Università degli Studi di PADOVA - FISICA - PADOVA(PD)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Amos MARITAN

Descrizione

Gli obiettivi scientifici che il gruppo di Padova si propone di raggiungere con questo progetto sono i seguenti

1) Ripiegamento errato e aggregazione di proteine

Ci proponiamo di finalizzare le nostre indagini per comprendere il processo di denaturazione e di aggregazione di proteine che conduce alla formazione delle fibrille amiloidi [4-6]. Il nostro intento è impiegare diversi approcci teorici al fine di descrivere le tappe successive del processo di aggregazione. Un meccanismo generale spesso (ma certo non sempre) osservato negli esperimenti consiste in una prima totale o parziale denaturazione della proteina, seguita da un'aggregazione preliminare in oligomeri privi di struttura che assumono poi una struttura ben definita resa stabile dalla formazione di conformazioni simili ai foglietti beta [70]. Tali strutture, le proto-fibrille, possono essere poi assemblate nelle fibrille amiloidi vere e proprie. Ad ogni stadio del nostro lavoro di modellizzazione lavoreremo in stretta collaborazione con i nostri partner sperimentali di Firenze. La possibilità di confrontare le proprietà di aggregazione di proteine diverse, le quali condividono però, almeno nei loro aspetti generali, la topologia dello stato nativo, fornirà un grande aiuto ai nostri intenti di studiare i principali fattori, sia indipendenti che dipendenti dalla sequenza, che influenzano il meccanismo di aggregazione. Il fatto che, perlomeno in linea di principio, tutte le sequenze proteiche possano essere indotte "in vitro" ad aggregarsi in fibrille amiloidi, indica l'esistenza di fattori fisici e chimici del tutto generali che determinano la formazione di fibrille, comuni a tutte le catene polipeptidiche [4]. In base ai risultati ottenuti col modello di ref. [38] abbiamo identificato questi fattori generici nell'effetto idrofobico, nel legame idrogeno e negli effetti sterici [36-39]. Il nostro approccio potrebbe essere quindi un conveniente punto di partenza, perlomeno al livello dello stadio preliminare dell'aggregazione in oligomeri e della conversione in strutture stabili simili ai foglietti beta. Al fine di introdurre l'eterogeneità della sequenza ci proponiamo di sviluppare potenziali statistici ottenuti specificatamente per il problema dell'aggregazione, che tengano conto della tendenza alla formazione di legami idrogeno tra residui appartenenti a filamenti beta adiacenti. Il potenziale si baserà sulle informazioni sulla strutture native proteiche ricavate dalle banche dati delle proteine (PDB) a partire dall'approssimazione quasi-chimica [15-17]. Il nostro obiettivo finale è quantificare la velocità di aggregazione degli oligomeri/proto-fibrille e fornire predizioni su quali siano i particolari residui che svolgono un ruolo cruciale nel promuovere l'aggregazione.

2) Proprietà conformazionali delle proteine nello stato denaturato.

Il ripiegamento delle proteine globulari più piccole non è tuttora ben compreso da un punto di vista fondamentale nella sua rapidità (dai millisecondi ai secondi) e riproducibilità. In accordo con il paradigma del "funnel" [50], il cammino verso lo stato nativo viene scolpito nel paesaggio di energia dalla minima frustrazione delle interazioni che caratterizzano le sequenze proteiche esistenti in natura. Comunque, affinché tale paradigma sia utile da un punto di vista sia teorico che pratico, rimane da comprendere come esso possa essere riprodotto da un modello teorico che prescinda da una conoscenza a priori dello stato nativo. Recenti esperimenti [51] suggeriscono che la soluzione di perlomeno una parte del problema possa essere ricercata nelle proprietà conformazionali dello stato denaturato D_phys. Tradizionalmente descritto tramite conformazioni "random coil" U, prive di ogni ordine strutturale, lo stato denaturato D_phys mostra invece in molti casi la persistenza di una topologia simile a quella dello stato nativo determinata dalla particolare sequenza in esame. Approfondiremo la nostra conoscenza delle proprietà degli stati denaturati, lavorando in collaborazione con i nostri partner sperimentali di Roma. Innanzitutto verificheremo l'ipotesi che minimi "bias" conformazionali di natura locale, dovuti alle differenti proprietà steriche ed elettrostatiche dei diversi residui, possano sommarsi lungo la catena producendo un "bias" conformazionale complessivo verso strutture secondarie tipiche dello stato nativo. Le proprietà conformazionali locali possono essere ricavate sia da un'indagine statistica accurata svolta su strutture del PDB o dedotte da simulazioni estensive di dinamica molecolare per segmenti corti di proteine (4-6 aminoacidi) in presenza di tutti gli atomi. L'informazione risultante verrà usata per definire un potenziale efficace per le sole interazioni locali lungo la catena. Tramite simulazioni Monte Carlo e tecniche basate sulla matrice di trasferimento si analizzeranno quindi le strutture statisticamente rilevanti che appaiono quando solo le interazioni locali hanno un ruolo rilevante, come si pensa avvenga per lo stato denaturato D_phys. Le nostre predizioni verranno confrontate con informazioni sperimentali già note e in particolare con i risultati dei nostri partner di Roma. All'interno di questo progetto, tenteremo inoltre di correlare la velocità e il cammino di ripiegamento, e gli stati di transizione di differenti proteine che condividono la stessa topologia nativa, con le caratteristiche dell'ensemble del loro stato denaturato.

3) Proteine intrinsecamente non strutturate

Le proteine intrinsecamente non strutturate (IUPs) sono molecole prive di ordine strutturale esteso, ma che spesso mostrano segni di una struttura residua di natura locale, senza nessuna evidenza di ripiegamento compatto e con una presenza minima di elementi di struttura secondaria [71]. Un aspetto chiave delle IUPs è la loro alta flessibilità conformazionale, che le permette di interagire con diverse molecole e adottare strutture relativamente rigide, in seguito a transizioni disordine–ordine che avvengono in presenza di ligandi naturali [72]: di recente sono stati osservati molti esempi di ripiegamento di una proteina accoppiato al suo legarsi ad un substrato/ligando, permettendo di mettere in luce nuovi aspetti nei meccanismi di riconoscimento molecolare [73]. La conformazione adottata dalle IUPs è quindi in larga misura determinata dal loro partner d'interazione, piuttosto che dalla sequenza aminoacidica, a differenza di quanto avviene per le proteine globulari. Il ripiegamento generato dal legame con un substrato, tipico della transizione di fase disordine–ordine di molte IUPs, è il modo in cui si realizza attivamente in natura il disegno di una struttura atta a compiere una specifica funzione biologica: le interazioni di contatto tra le proteine disordinate e il partner di legame sono state selezionate dall'evoluzione, poiché un'opportuna configurazione geometrica può guidare efficientemente il ripiegamento verso la struttura desiderata. Il nostro obiettivo è far luce sugli effetti che le interazioni di contatto tra una IUP e il suo bersaglio hanno sul paesaggio di energia della prima, selezionando il suo stato fondamentale fra un ristretto numero di possibili stati nativi, a seconda delle proprietà geometriche dei legami fra l'IUP e il suo partner. Useremo il modello del tubo modificato [36-39], poiché l'esistenza di un paesaggio di energia pre-scolpito lo rende un caso ideale per dimostrare l'effettiva abilità di una proteina nel ripiegare in diversi stati nativi in dipendenza da diverse geometrie di legame, senza che sia necessario considerare una descrizione delle interazioni troppo dettagliata.

4) Ripiegamento e disegno di proteine da un punto di vista fondamentale

Il nostro obiettivo è affrontare in modo sistematico il problema del ripiegamento e del disegno di proteine all'interno del nostro approccio descritto in precedenza [36-39], con la prospettiva di arricchire il nostro modello con una descrizione più specifica e dettagliata della catena polipeptidica. Tali problemi risultano comunque relativamente semplici se ci si basa su un modello che contenga gli ingredienti essenziali comuni a tutte le proteine e i cui pochi parametri siano fissati in modo da rimanere vicino alla fase marginalmente compatta, come trovato in [36-39]. Innanzitutto cercheremo di disegnare sequenze di 48 o più amminoacidi nel nostro modello semplificato, usando come strutture bersaglio i minimi già determinati nel paesaggio di energia prescolpito. Come secondo obiettivo, vogliamo studiare il ripiegamento di proteine globulari di moderata lunghezza in modo da ottenere il corretto stato nativo nell'ambito del nostro campo di forza coarse-grained, basandoci solamente sulla conoscenza della struttura primaria. Questi studi non sono da intendersi come alternativi, ma piuttosto complementari ai sofisticati algoritmi che vari gruppi stanno sviluppando allo scopo di predire la struttura nativa. Il fine di questi ultimi è infatti quello di prevedere in modo corretto la struttura nativa di una data sequenza proteica, senza dover inquadrare i processi di ripiegamento e altri importanti aspetti delle fisica delle proteine nell'ambito di una prospettiva unitaria, come invece vogliamo fare noi. Abbiamo già ottenuto alcuni risultati preliminari molto incoraggianti. Infatti nel nostro modello [38], che utilizza solo due classi di amminoacidi (idrofobico e polare), siamo riusciti ad ottenere la corretta topologia nativa di due piccoli domini (1GB1 e 1BDD) appartenenti ad immunoglobuline.

5) Paesaggio di energia nelle vicinanze dello stato nativo

Nel campo delle proteine ci sono vari problemi legati alle proprietà della struttura nativa e delle fluttuazioni intorno ad essa. Le attuali simulazioni di dinamica molecolare (DM) con modelli "all-atom" permettono di seguire numericamente l'evoluzione dinamica delle proteine in soluzione fino a una scala ben inferiore al microsecondo. Purtroppo tali scale temporali hanno una utilità limitata per la maggior parte dei processi biologici e degli esperimenti biofisici (come il riconoscimento dei ligandi proteici, e le interazioni DNA-proteine). Sfortunatamente il numero di gradi di libertà da tenere in considerazione è troppo elevato per prendere in considerazione il contributo di ogni atomo e si sono tentati vari approcci "coarse-grained" per passare dalle scale temporali delle simulazioni DM a quelle di rilievo biologico [52-55]. Un contributo centrale in questo senso è stato l'osservare che la dinamica sovrasmorzata di una proteina nel suo solvente può essere descritta da un potenziale quadratico efficace [56]. In tali modelli, l'energia è data da accoppiamenti armonici tra centroidi spazialmente vicini (che rappresentano gli amminoacidi), i quali sono posizionati in corrispondenza degli atomi C-alfa e/o C-beta. Questi approcci [53,55] risultano essere in buon accordo con i dati sperimentali e le simulazioni DM "all-atom" [57,58]. Ci sono però altri casi molto importanti, nei quali i dettagli chimici delle sequenze proteiche non possono essere trascurati. Per esempio la mancanza di dettagli molecolari nelle regioni delle proteine che sono coinvolte nei processi di riconoscimento molecolare (RM), come il sito attivo di un recettore, ha finora impedito lo studio di tali processi. In collaborazione con gruppi di Trieste e Losanna vogliamo sviluppare un approccio ibrido in grado di sfruttare il fatto che i processi di MR non coinvolgono mai l'intera superficie proteica e sono spesso molto localizzati. Nello stesso spirito dell'approccio ibrido a metà fra meccanica quantistica e meccanica molecolare [59], vorremmo separare dal sistema una piccola regione, studiata usando il contributo di ogni singolo atomo (es. 43a1 GROMOS96 [60]), mentre vorremmo trattare il resto della proteina con il solvente usando il tipo di approssimazione "coarse-grained" già spiegata. Usando queste due tipologie di analisi, desideriamo studiare varie problematiche. In collaborazione con l'U.R. di Bari vogliamo approfondire: A) Le caratteristiche generali di filamenti e fibre biologiche quali i filamenti citoscheletrici (microtubuli e actina); B) L'ossidasi del citocromo c mitocondriale, una proteina di membrana che ha un ruolo cruciale nella respirazione cellulare aerobica. In collaborazione con il laboratorio di biomolecole dell'ENS (Parigi), vogliamo anche caratterizzare il comportamento dell'energia libera di una proteina in prossimità del suo stato nativo con l'intento di chiarire la relazione tra i cambiamenti conformazionali e l'attività biologica delle proteine. In questo ambito è cruciale riuscire a caratterizzare opportunamente la mobilità dei residui coinvolti nella reazione enzimatica. I modelli sopra descritti sono anche particolarmente adatti a studiare le modificazioni strutturali in presenza di una forza esterna e in questo senso rappresentano una base per interpretare i dati che si otterranno all'ENS negli esperimenti con singola molecola.

6) Fasi a cristalli liquidi e proteine

Le fasi fluida e cristallina della materia possono essere facilmente comprese analizzando il comportamento di un sistema di sfere rigide [61-62]. Considerazioni di simmetria hanno spesso un ruolo centrale nel determinare la natura dell'ordine di un sistema [63]. In questo modo, un insieme di sfere rigide può trovarsi sia nella fase liquida (isotropa) che in quella cristallina, con una transizione del primo ordine tra di esse qualora si vari la densità di impaccamento. I cristalli liquidi, che esistono in una fase intermedia tra le due precedenti, si ottengono quando le particelle costituenti sono anisotrope, come a es. un sigaro o un disco [64-65]. Il fatto che la fase liquido-cristallina si trovi vicino alla transizione alla fase liquida, le permette di essere particolarmente sensibile alle perturbazioni [64-65]. Generalizzando il problema delle sfere rigide a quello di tubi incomprimibili [66], si può visualizzare un tubo come il limite continuo di una catena discreta di dischi o monete legati tra loro [67], di raggio fissato e separati uno dall'altro da una distanza che tende a zero nel limite continuo. L'anisotropia intrinseca associata al disco riflette il fatto che localmente vi è una direzione privilegiata data dalla posizione degli oggetti adiacenti lungo la catena. Una descrizione alternativa di una catena discreta è quella in cui gli oggetti legati tra loro a una data distanza sono delle sfere. La differenza sostanziale tra le due descrizioni è la diversa simmetria degli oggetti legati. Nel limite continuo di una catena di sfere, ogni singolo elemento tende a essere circondato isotropicamente da altre sfere, a differenza del caso di un tubo per il quale segmenti vicini devono essere posizionati parallelamente tra loro. Anche per particelle non vincolate, deviazioni dalla simmetria sferica (per es. rimpiazzando le sfere rigide con degli oggetti a forma di sigaro) portano alla fase di cristallo liquido [64,65] descritta sopra. Allo stesso modo abbiamo constatato che un tubo e una catena di sfere portano a comportamenti molto diversi [67,68]. Il modello a tubo di un polimero presenta una fase marginalmente compatta compresa tra una fase non compatta ("swollen") e una isotropa compatta. Questo regime esibisce una drastica diminuzione di entropia, ed è caratterizzati da eliche con un ben determinato rapporto fra passo e raggio in accordo con quello delle proteine [36], forcine e foglietti planari con la tipica struttura a zigzag. Sulla base di questi risultati desideriamo: A) esaminare la struttura delle proteine nel PDB nei termini dei parametri d'ordine dei cristalli liquidi [69] e verificare anche se le proteine possano essere considerate come delle nano-gocce di cristalli liquidi; B) In collaborazione con i nostri partner di Venezia, usare una teoria di campo medio per studiare analiticamente il diagramma di fase di semplici modelli meccanico-statistici di proteine.