RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

APPROCCIO TEORICO-SPERIMENTALE AGLI STATI NON-NATIVI DELLE PROTEINE: FORMAZIONE DI FIBRILLE AMILOIDI, PROTEINE DISORDINATE E DENATURATE

Università di riferimento

Università degli Studi di BARI - BIOCHIMICA MEDICA, BIOLOGIA MEDICA E FISICA MEDICA - BARI(BA)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Gianluca LATTANZI

Descrizione

Parte A. Sistemi Meccanochimici.
1. Approccio teorico a modelli di cinetica chimica.
Intendiamo estendere le nostre precedenti ricerche sulle procedure di semplificazione con un'analisi dettagliata delle connessioni con la teoria del complesso attivato di Kramers [56]. In particolare, vorremmo confrontare la soluzione di una semplice equazione di Fokker-Planck in una dimensione con la corrispondente master equation, ottenuta per mezzo della procedura di semplificazione da noi proposta. Tale confronto dovrebbe consentire di ottenere importanti informazioni sull'accuratezza della nostra procedura e condurre, eventualmente, al suo miglioramento. Ciò sarebbe di grande utilità per il campo dei motori molecolari, in quanto la dipendenza dalla forza di tipo Arrhenius, comunemente usata, conduce, anche con parametri del tutto plausibili, a velocità che aumentano esponenzialmente con la forza, un risultato in contrasto con il principio di conservazione dell'energia. Tuttavia probabilità di transizione non-Arrhenius ottenute con la nostra procedura di semplificazione consentono di riprodurre correttamente la dipendenza lineare per forze elevate, che è attesa per un oggetto che si muove in un ambiente viscoso. In tale contesto, la dipendenza esponenziale di tipo Arrhenius costituisce solo un'approssimazione per piccole forze alla complessa velocità di reazione che risulterebbe dalla soluzione dell'equazione di Fokker-Planck ed è infatti ristabilita nel limite di piccole forze. Questo studio consentirà di contribuire allo sviluppo di modelli teorici nel campo della fisica statistica di non-equilibrio e sarà realizzato in stretta collaborazione con il gruppo di Padova.
2. Cinetica dei motori molecolari: chinesina, miosina V, miosina II.
La sempre crescente mole di dati raccolti per diversi motori molecolari, come la chinesina [13-19], la miosina V [20,21] e la miosina II [22] a livello di singola molecola, costituisce un ottimo banco di prova per verificare la validità della procedura di semplificazione e dei modelli meccanochimici da noi proposti. Infatti, il nostro modello cinetico può essere facilmente utilizzato per calcolare quantità come la velocità del motore, il tasso di consumo di ATP, il passo effettivo ed il parametro di stocasticità (o numero di Peclet), che possono essere direttamente confrontati con i dati sperimentali. Il numero ridotto di parametri nel nostro modello con probabilità di transizione dipendenti dalla forza dovrebbe consentire di ottenere informazioni più dettagliate sulle dimensioni dei cambiamenti conformazionali coinvolti nei cicli enzimatici e rende possibile determinare le probabilità di transizione con estrema precisione. I motori molecolari sopra riportati sono di chiara rilevanza biomedica, in quanto il loro malfunzionamento risulta coinvolto in un gran numero di patologie. Questa parte del progetto coinvolgerà il gruppo di Padova.
3. Estensione all'F1F0 ATP sintasi.
L'F1F0 ATP sintasi, noto anche come Complesso V, è l'enzima primariamente responsabile della produzione di ATP, il "carburante" delle proteine motrici. Esso converte efficientemente l'energia immagazzinata nel gradiente elettrochimico transmembranario in energia meccanochimica, per guidare la sintesi di ATP. Tuttavia, a differenza di altri motori molecolari che lavorano solo in una direzione, il meccanismo che conduce alla produzione di ATP può essere invertito, conducendo al consumo di ATP. Dato il suo ruolo rilevante nella produzione di energia, questo complesso enzima costituisce il principale obiettivo di ricerca di diversi gruppi, incluso il gruppo di Sergio Papa nella nostra Università. Recentemente, modelli meccanochimici, continui e su reticolo, sono stati applicati a questa classe di motori molecolari rotatori e reversibili [23,24], pertanto vorremmo estendere il nostro approccio all'analisi del ciclo cinetico dell'F1F0 ATP sintasi in entrambe le sue direzioni di funzionamento. Queste ricerche verranno condotte in stretta collaborazione con i nostri colleghi sperimentali nel gruppo di Sergio Papa.
4. Traslocazione di polimeri attraverso stretti canali proteici.
Il trasporto di biopolimeri attraverso larghi canali di membrana riveste un'importanza centrale in processi come il trasferimento di geni per trasduzione ed il trasporto di RNA attraverso i pori nucleari. Misure di corrente ionica in singoli canali sono state recentemente utilizzate per studiare il trasporto di biopolimeri, ed in particolare singole catene di DNA ed RNA, attraverso canali nanoscopici [32,33]. Sottoposti ad un campo elettrico, i polinucleotidi carichi negativamente possono essere catturati e spinti attraverso il canale nel processo definito come "traslocazione". Durante la traslocazione, la corrente ionica attraverso il canale è bloccata quasi del tutto, indicando la presenza del polimero nel canale. È stato osservato che le interruzioni di corrente dipendono da proprietà del polimero, come la composizione in nucleotidi, la lunghezza e la struttura secondaria, e da parametri fisici come l'intensità del campo elettrico, la temperatura e la forza ionica. Tale sistema meccanochimico è perfettamente adatto per verificare la dipendenza dalla forza delle probabilità di transizione da noi proposta, in quanto la forza in questo caso è proporzionale all'intensità del campo che può essere direttamente controllata negli esperimenti. Proseguendo alcuni studi preliminari, intendiamo applicare il nostro modello ai dati attualmente disponibili, nella speranza di poter verificare la nostra teoria su un banco di prova che è notevolmente diverso da un motore molecolare, e di contribuire a questo attivo settore di ricerca. Questa parte del progetto trarrà profitto dalla collaborazione con il gruppo di Padova.

Parte B. Filamenti e fibre biologici.
1. Filamenti citoscheletrici: microtubuli ed actina.
Proseguendo la fruttuosa collaborazione con il gruppo teorico di Erwin Frey (ora alla Ludwig-Maximilian Universitaet di Monaco in Germania) e due gruppi sperimentali (il gruppo di Ernst Stelzer al Laboratorio Europeo di Biologia Molecolare di Heidelberg, in Germania e il gruppo di Ernst-Ludwig Florin all'Università del Texas ad Austin, negli Stati Uniti), intendiamo proseguire nello studio delle proprietà meccaniche di singoli microtubuli e filamenti di actina, che sono cruciali nel determinare le proprietà elastiche del citoscheletro. I microtubuli possiedono una complessa organizzazione strutturale, che è il risultato di interazioni molecolari finemente adattate e conduce a proprietà inusuali di tali filamenti su scala cellulare. Ad esempio, sono capaci di generare forze a diverse scale di lunghezza, ma le loro estremità sono sempre sufficientemente flessibili per poter cercare in modo efficiente molecole leganti sulle membrane cellulari, un processo che risulta essenziale per la loro funzione nella cellula [12]. I nostri recenti risultati [42] forniscono una prima spiegazione di come i microtubuli riescano a realizzare le loro specifiche proprietà meccaniche da un ottimo sfruttamento delle interazioni molecolari. Poiché un numero piuttosto limitato di filamenti cellulari deve svolgere un gran numero di funzioni, la nostra ipotesi è che la cellula sia capace di modulare le proprietà di questi filamenti secondo le necessità. In collaborazione con i nostri colleghi sperimentali all'EMBL ed all'Università del Texas, intendiamo caratterizzare a fondo le proprietà elastiche dei microtubuli in presenza di vari fattori fisico-chimici (sostanze chimiche di importanza fisiologica e temperatura). Allo stesso tempo, in collaborazione con il gruppo di Erwin Frey e l'unità di ricerca di Padova, vorremmo costruire una descrizione teorica di tali proprietà attraverso diverse strategie di semplificazione: useremo il modello wormlike chain e la teoria dell'elasticità lineare per ottenere informazioni sulle proprietà elastiche dei microtubuli, in particolare la determinazione della loro lunghezza di persistenza, e vorremmo introdurre potenziali statistici costruiti in modo specifico per l'aggregazione dell'actina e della tubulina, seguendo lo stesso approccio proposto dal gruppo di Padova per le fibrille amiloidi. Questa analisi consentirà di chiarificare il ruolo dell'architettura dei filamenti citoscheletrici nel determinarne le proprietà meccaniche.
2. Fibrille amiloidi.
Intendiamo estendere il nostro approccio allo studio di altre fibre biologiche di rilevanza medica, in particolare le fibrille amiloidi che costituiscono il principale obiettivo dei nostri colleghi sperimentali dell'unità di ricerca di Firenze. In tale ambito, la prospettiva geometrica introdotta dall'unità di ricerca di Padova [51] sembra particolarmente promettente, in quanto prevede l'aggregazione di proteine su base generale. Pertanto vorremmo contribuire agli obiettivi di ricerca proposti dal gruppo di Padova (rimandiamo al loro progetto per ulteriori dettagli), nel tentativo di ottenere la descrizione più completa di queste strutture a diversi livelli di dettaglio e di raggiungere una comprensione esaustiva delle loro proprietà meccaniche, condizione necessaria per poter chiarire le condizioni che determinano lo sviluppo di malattie associate alla formazione di fibrille amiloidi.

Parte C. Modelli semplificati di proteine.
1. Sviluppo di efficienti modelli semplificati.
I modelli Gaussiani possono essere considerati come la prima più economica approssimazione alla classe più generale dei modelli di Go [57], i quali si basano principalmente sull'informazione topologica ottenuta dalle strutture proteiche ed assumono potenziali semplificati per le interazioni tra amminoacidi, idealmente rappresentati da sferette. Nonostante tali modelli siano più adatti per l'esplorazione del profilo di energia libera nei pressi dello stato nativo, sono stati applicati con successo all'analisi dei percorsi di ripiegamento. Intendiamo estendere il campo di applicazione dei modelli di Go allo studio della funzione delle proteine, nel tentativo di colmare il divario con descrizioni più accurate (dinamica molecolare con tutti gli atomi) senza necessariamente aumentarne la complessità computazionale. La funzione biologica svolta da una proteina richiede, in generale, cambiamenti conformazionali, ovvero piccoli cambiamenti nella forma delle singole proteine determinati da diverse molecole leganti. Si ritiene che lo studio dei cambiamenti conformazionali richieda una descrizione dettagliata delle componenti chimiche dell'intera proteina o del complesso proteico. Questo è senz'altro vero per il sito attivo degli enzimi, ma potrebbe essere ridondante per l'intera proteina, il cui comportamento è largamente dominato dalle sue proprietà meccaniche. La nostra principale assunzione è che alcuni cambiamenti conformazionali avvengano senza alterare in modo sostanziale la topologia della struttura, mentre la proteina esplora conformazioni vicine allo stato nativo nel profilo di energia libera. Tale ipotesi si fonda su risultati sperimentali [58,59] ed è sicuramente necessario dedicare ricerche sperimentali e teoriche alla sua verifica. In stretta collaborazione con l'unità di ricerca di Padova, vorremmo sviluppare approcci semplificati che superino il paradigma dei modelli di Go, usando diversi livelli di dettaglio nella descrizione delle componenti della proteina allontanandosi dal sito attivo verso il resto della struttura (rimandiamo al progetto dell'unità di ricerca di Padova per ulteriori dettagli). I modelli saranno confrontati con i dati provenienti da simulazioni atomistiche di dinamica molecolare realizzate su proteine le cui dimensioni consentono tale confronto, e successivamente applicati alla varietà di macromolecole e complessi proteici le cui dimensioni impediscono un qualunque studio dettagliato su scala atomica.
2. Applicazioni al Citocromo c Ossidasi.
Il citocromo c ossidasi svolge un ruolo essenziale nella respirazione aerobica cellulare, riducendo l'ossigeno in un processo accoppiato con il pompaggio protonico attraverso la membrana mitocondriale [60]. Due diverse conformazioni, corrispondenti allo stato completamente ossidato ed allo stato ridotto, sono state recentemente risolte, suggerendo possibili ruoli funzionali di diversi residui situati nella sottounità I [61]. La sottounità I consente lo studio con modelli che includono il dettaglio atomico: tuttavia l'intero complesso può essere studiato solo con modelli semplificati. Questa proteina è l'obiettivo di intense ricerche sperimentali nel gruppo di Sergio Papa nel nostro istituto e costituisce dunque un interessante banco di prova per i nostri modelli semplificati. Intendiamo affrontare alcune delle domande poste dalla ricerca sperimentale su questo enzima attraverso un confronto dei cambiamenti conformazionali osservati negli esperimenti e ottenuti da modelli Gaussiani e dai modelli da noi proposti. Il nostro studio potrebbe contribuire a determinare possibili siti chiave per esperimenti di mutagenesi da parte dei nostri colleghi biochimici. Questa parte del progetto verrà realizzata in collaborazione con il gruppo di Sergio Papa e con l'unità di ricerca di Padova.
3. Analisi comparata delle teste motrici della chinesina e della miosina.
Il meccanismo che consente alla chinesina ed alla miosina di convertire in lavoro meccanico l'energia proveniente dall'idrolisi dell'ATP costituisce un'attiva area di ricerca. Proseguendo i nostri lavori preliminari sul monomero e sul dimero della chinesina [55], vorremmo estendere la nostra analisi al dominio motore della miosina, che è strutturalmente simile al corrispettivo dominio della chinesina. Infatti, tre diverse conformazioni della miosina [62,63] sono state ottenute da strutture cristallografiche, fornendo preziose informazioni su come piccoli riarrangiamenti del dominio motore vengano amplificati in movimenti del braccio-leva per la generazione della forza. Le due strutture disponibili per la chinesina non forniscono un quadro altrettanto chiaro del meccanismo di conversione energetica. Uno studio preliminare basato sul modello Gaussiano [64] ha contribuito a chiarire questo scenario, ma ha evidenziato differenze intrinseche tra la chinesina e la miosina. Tale analisi era basata su strutture che non comprendevano il substrato ed è dunque possibile che l'interazione con esso (il dimero di tubulina, l'unità fondamentale dei microtubuli) influenzi i cambiamenti conformazionali, come suggerito da osservazioni in microscopia elettronica [65] e confermato da nostri studi preliminari. Vorremmo dunque estendere la nostra analisi al confronto tra i sistemi dell'acto-miosina e della tubulina-chinesina. Tali sistemi costituiscono infatti un'importante applicazione per i modelli da noi proposti in quanto le loro dimensioni impediscono ogni approccio che comprenda il dettaglio atomico. Questa parte del progetto verrà realizzata in stretta collaborazione con il gruppo di Padova.