RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

APPROCCIO TEORICO-SPERIMENTALE AGLI STATI NON-NATIVI DELLE PROTEINE: FORMAZIONE DI FIBRILLE AMILOIDI, PROTEINE DISORDINATE E DENATURATE

Università di riferimento

Università degli Studi di FIRENZE - FIRENZE(FI)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Niccolo' TADDEI

Descrizione

Questa UR studierà il ruolo svolto dalla sequenza e dalle caratteristiche della struttura tridimensionale di una proteina nel processo di aggregazione e nello sviluppo di fibrille amiloidi, mediante l'impiego di una serie di proteine della stessa famiglia, chiamate acilfosfatasi. Sei diverse proteine della famiglia dell'acilfosfatasi e appartenenti a diversi organismi sono già disponibili in questo laboratorio (Taddei et al., 1999; Chiti et al., 2001; Pieri et al., 1998; Degl'Innocenti et al., 2003; Plakoutsi et al., 2004). Queste proteine appartengono a Homo sapiens (mAcP e ctAcP), Drosophila melanogaster (AcPDro1 e AcPDro2), E. coli (HypF-N) e Sulfolobus solfataricus (Sso AcP). La struttura tridimensionale è stata determinata per cinque di queste proteine (mAcP, ctAcP, HypF-N, AcPDro2 e Sso AcP). Confrontando queste strutture si nota una similitudine di topologia, nonostante Sso AcP presenti una caratteristica particolare, una coda N-terminale non strutturata di circa 13 residui. Le sei proteine mostrano un'omologia di sequenza significativa, anche se in alcuni casi l'identità di sequenza è bassa, non superiore al 20-30%. Il confronto fra i risultati ottenuti con proteine diverse potrà servire per comprendere i principi di base dell'aggregazione proteica. Inoltre, il confronto fra proteine strutturalmente correlate ma con una limitata identità di sequenza fornisce l'opportunità di comprendere se elementi come la sequenza amminoacidica o certe caratteristiche strutturali sono fattori chiave nell'aggregazione proteica.
Questa UR ha la possibilità di produrre varianti mutazionali praticamente illimitate di una proteina specifica. Usando kit la cui funzionalità è ampiamente provata, uno o più residui amminoacidici possono essere sostituiti con amminoacidi desiderati. Questa unità di ricerca ha un'esperienza di lungo corso nel campo dell'ingegneria proteica e ha prodotto e pubblicato dati riguardanti più di 100 varianti di mAcP e HypF-N (Chiti et al., 1999; Chiti et al., 2002a; Chiti et al., 2002b; Calloni et al., 2005). Ad oggi la nostra UR è dotata di tecnologia adeguata per la produzione e la purificazione in parallelo di 5 varianti mutazionali alla volta. I metodi di ingegneria proteica sono fondamentali per determinare l'identità delle regioni di sequenza e dei residui amminoacidici coinvolti nelle diverse fasi dell'aggregazione proteica.
Gli strumenti e l'equipaggiamento richiesto per il compimento del progetto proposto sono disponibili, se non indicato in modo diverso, in questa UR o nell'ambito dell'Università di Firenze. Per mutare i geni delle proteine desiderate saranno utilizzati kit per il rapido inserimento di una mutazione basati sull'impiego della reazione a catena della polimerasi (PCR). I geni mutati e wild-type saranno espressi e il risultante prodotto genico sarà purificato usando dei protocolli il cui funzionamento è comprovato(Taddei et al., 1996, 2001; Chiti et al., 2002a, 2002b). La tecnica del rivelamento del light scattering dinamico (DLS), così come gli esperimenti di cromatografia ad esclusione in HPLC, saranno utilizzati per individuare la presenza e determinare la dimensione di aggregati appena questi si formano. Esperimenti di cross-linking foto-indotto di proteine non modificate (PICUP) saranno effettuati e questi, insieme ai gel elettroforetici su sodio-dodecil solfato poliacrilammide (SDS-PAGE), serviranno per identificare aggregati della proteina di tipo oligomerico o di maggiori dimensioni rivelandone la dimensione approssimativa. Misure di dicroismo circolare (CD) nel lontano UV e di spettroscopia infrarossa in trasformata di Fourier (FT-IR) saranno utilizzate per determinare la presenza di struttura a foglietto beta o di altro tipo negli aggregati. Saggi colorimetrici, basati sulla capacità delle fibrille amiloidi e dei loro precursori di legarsi al Rosso congo (CR) e alla tioflavina T (ThT), saranno utilizzati per monitorare la formazione di aggregati a partire dalle varianti mutazionali delle proteine (Chiti et al., 2002a, 2002b). Uno spettrofotometro ed uno spettrofluorimetro saranno usati per effettuare questi saggi in presenza rispettivamente di CR e di ThT. I cambiamenti conformazionali rapidi che avvengono nell'ambito di qualche millisecondo, come le reazioni di folding e di unfolding coinvolte nei primi passaggi del processo di aggregazione, saranno monitorati mediante l'uso di due strumenti a flusso interrotto (stopped-flow), accoppiati a sistemi di rivelazione in fluorescenza e in dicroismo circolare. L'analisi della morfologia degli aggregati sarà effettuata per mezzo di microscopia a trasmissione elettronica. Una collaborazione con la Prof. Gliozzi dell'Università di Genova, renderà possibile l'utilizzo anche della microscopia a forza atomica per l'analisi morfologica e per la determinazione della dimensione degli aggregati proteici.
I dati sperimentali raccolti in questa UR saranno usati per valutare la correttezza dei modelli proposti da una UR che si occupa di aspetti teorici (UR Maritan, Padova). La descrizione della transizione strutturale cui vanno incontro le proteine coinvolte nell'aggregazione amiloide non sarà costruita ab initio dall'altra UR basandosi su soli dati teorici, ma sarà accoppiata direttamente ai dati che emergeranno dagli studi sperimentali. Questi ultimi saranno utilizzati sia per valutare la validità dei modelli proposti per il processo di aggregazione, sia come contributo per la ricerca di nuovi modelli e di simulazioni di meccanismi di aggregazione. La prima domanda a cui potremo rispondere dopo aver sfruttato la sinergia tra parte teorica e parte sperimentale riguarda le regioni della sequenza che promuovono l'aggregazione dell'intera proteina. L'approccio di ingegneria proteica può aiutare a comprendere il ruolo svolto da ogni singolo residuo amminoacidico nel processo di aggregazione. Un modello o un algoritmo che si fondino sullo sviluppo dei dati determinati sperimentalmente a livello di ogni singolo residuo possono chiarire le caratteristiche chimico-fisiche dell'aggregazione, oltre che rappresentare uno strumento predittivo per identificare le regioni che promuovono l'aggregazione. Mentre gli studi sperimentali ci potranno permettere di separare le varie fasi dell'aggregazione (per esempio la formazione di stati parzialmente denaturati, di oligomeri, di protofibrille e di fibrille), il lavoro teorico potrà delucidare gli aspetti chimico-fisici di ciascuna di queste fasi.
Nell'ambito di questo progetto provvederemo anche a studiare la velocità delle varie fasi dell'aggregazione proteica. Questa può essere misurata facilmente su catene polipeptidiche diverse. Algoritmi o processi di simulazione che riproducono le velocità misurate sperimentalmente potranno essere elaborati allo scopo di identificare i fattori chiave che determinano la velocità della formazione di oligomeri, protofibrille e fibrille. Lo studio del processo di aggregazione delle proteine appartenenti alla famiglia delle acilfosfatasi mostra l'esistenza di diversi meccanismi di aggregazione. Abbiamo visto, per esempio, che mentre HypF-N aggrega per mezzo di uno stato parzialmente denaturato in condizioni vicine a quelle fisiologiche, Sso AcP forma un oligomero con struttura simile a quella nativa che solo in un secondo momento si riorganizza per formare un oligomero contenente foglietto beta tipico delle protofibrille sferiche o a catena. I modelli che simulano questi comportamenti serviranno a chiarire i determinanti dei due diversi meccanismi.