RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

APPROCCIO TEORICO-SPERIMENTALE AGLI STATI NON-NATIVI DELLE PROTEINE: FORMAZIONE DI FIBRILLE AMILOIDI, PROTEINE DISORDINATE E DENATURATE

Università di riferimento

Università degli Studi di ROMA "La Sapienza" - SCIENZE BIOCHIMICHE - ROMA(RM)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Carlo TRAVAGLINI ALLOCATELLI

Descrizione

Questo progetto utilizza differenti proteine e moduli strutturali per ottenere, tramite lo sviluppo di strumenti e metodologie sperimentali innovative, una descrizione quantitativa del processo di folding in alcuni sistemi modello. Tali informazioni, grazie anche alla correlazione con esperimenti di dinamica molecolare e/o Monte Carlo (in collaborazione con la U.R. Padova), permetteranno di derivare le regole generali che controllano il processo di folding rendendo possibile la risposta ad alcune domande cruciali: i) a quale stadio del processo viene selezionato il meccanismo di folding seguito? ii) esistono proprietà topologiche ricorrenti nella struttura degli stati di transizione? iii) è possibile sfruttare le nostre conoscenze sui meccanismi di folding per progettare proteine sintetiche caratterizzate da nuove strutture e/o funzioni? Le informazioni sui meccanismi di folding, ottenute in vitro su semplici sistemi sperimentali, saranno correlate con gli studi sui processi di folding errato (misfolding) condotti dall U.R. Firenze. Riguardo ai vari punti appena menzionati saranno cruciali i contributi del gruppo di Padova nell'ambito del loro approccio basato sul paradigma del "pre-sculpted free energy landscape" (13).
Sistemi modello utilizzati
i) La famiglia dei citocromi c (il citocromo c551 dal batterio mesofilo Pseudomonas aeruginosa, i citocromi c552 dai batteri termofili Thermus thermophilus ed Hydrogenobacter thermophilus). Queste piccole proteine ad alfa-elica, rappresentano un sistema ideale per studiare i meccanismi di folding grazie alle loro caratteristiche di stabilità, solubilità ed alla presenza de un gruppo prostetico covalentemente legato (il gruppo eme) che permette di utilizzare diverse tecniche spettroscopiche. Gli studi condotti nel nostro laboratorio e da altri gruppi di ricerca hanno indicato che un insieme limitato di interazioni terziarie topologicamente conservate può guidare il folding di citocromi evolutivamente distanti attraverso lo stesso stato parzialmente strutturato, che tuttavia può giocare ruoli cinetici differenti (intermedio o stato di transizione) a seconda dei parametri energetici associati (14-16). Queste osservazioni ci hanno permesso di proporre un meccanismo di folding consenso per questa famiglia proteica (17). Sistemi per la espressione in E. coli e per la produzione di mutanti sito-specifici del citocromo c551 di P. aeruginosa, del citocromo c552 di H. thermophilus sono già disponibili in questo laboratorio.
ii) Il dominio PDZ (post-synaptic density-95/discs large/zonula occludens-1) da tirosina fosfatasi murina (PDZ2 da PTP-BL). I domini PDZ sono piccoli domini globulare di struttura alfa-beta presenti in diverse proteine dove svolgono funzioni importanti nel riconoscimento e nell'assemblaggio di complessi proteici. Protocolli sperimentali per la espressione in E. coli e per la produzione di mutanti sito-specifici per questi sistemi sono già disponibili in questo laboratorio.
Gli obiettivi principali del progetto sono:
1) Descrizione degli eventi precoci del folding.
Alcune osservazioni sperimentali hanno dimostrato per alcune proteine modello tra cui la famiglia dei citocromo di tipo c, la formazione nella finestra temporale dei microsec, di una specie collassata (Dphys) con proprietà strutturali diverse da quelle dello stato denaturato U (9, 18, 19). La transizione strutturale tra lo stato completamente denaturato U e la specie Dphys è attualmente oggetto di dibattito. Studi teorici hanno in prima istanza suggerito che tale, rapido, processo possa seguire un modello non cooperativo (20). Tale processo implicherebbe una estrema plasticità strutturale dello stato denaturato che, a seguito della variazione delle condizioni sperimentali, può assumere conformazioni più compatte. In tale scenario, definito "downhill", la transizione è di tipo continuo (transizione di secondo ordine). I dati sperimentali ad oggi disponibili su un limitato numero di sistemi modello non chiariscono se la transizione precoce tra U e Dphys segua una cinetica di secondo ordine o un classico processo di primo ordine limitato da una barriera di attivazione. A questo proposito il sottoprogetto è focalizzato al chiarimento di tale evento, con particolare attenzione alle proprietà strutturali e meccanicistiche dello stato Dphys.
Nel caso del citocromo c eucariotico diverse tecniche spettroscopiche sono state utilizzate in combinazione con tecniche di cinetica super-rapida per mettere in evidenza che lo stato collassato è caratterizzato da alcune proprietà strutturali (contenuto in alfa-elica – ref. 9; raggio di girazione – ref.18) caratteristiche di uno specie globulare parzialmente organizzata. Il ruolo diretto di specifiche interazioni secondarie e/o terziarie rimane tuttavia oscuro e a tutt'oggi non è stato condotto alcuno studio basato su phi-value analysis sulla specie collassata. Il nostro scopo è quello di identificare eventuali interazioni terziarie chiave nella stabilizzazione della specie Dphys nel caso della famiglia dei citocromi di tipo c.
Primo anno. Costruzione e messa a punto di un prototipo di apparato di mescolamento a flusso continuo sulla base dello strumento utilizzato dal gruppo del Prof. A.R. Fersht (Cambridge, UK). Le caratteristiche della cella di mescolamento dovranno assicurare tempi morti di reazione dell'ordine di 50-100 microsec. L'apparato dovrà essere dotato di un sistema di rilevazione del segnale ad alta sensibilità basato sulla tecnologia CCD e ottimizzato per rilevare segnali nella regione dell'ultra-violetto. Particolare attenzione sarà rivolta alla possibilità di sviluppare uno strumento in grado di monitorare reazioni chimiche sia tramite spettroscopia di fluorescenza (variazioni conformazionali della struttura terziaria) che di assorbanza (reazioni caratteristiche di emoproteine come i citocromi c).
Secondo anno. Costruzione di mutanti sito-specifici in posizioni chiave per il meccanismo di folding dei citocromi c. Caratterizzazione estensiva della cinetica super-rapida di mutanti sito-specifici di diversi citocromi batterici (citocromo c551 da Pseudomonas aeruginosa, citocromo c552 da Hydrogenobacter thermophilus). Saranno studiati alcuni mutanti del citocromo c551 da Pseudomonas aeruginosa già disponibili in laboratorio di cui è stata caratterizzata la cinetica di folding nella scala temporale dei millisecondi e che mappano alla interfaccia tra le 2 alfa-eliche N- e C-terminali. Definizione del ruolo meccanicistico della specie collassata e eventuale identificazione delle interazioni terziarie chiave che ne determinano la stabilità.
2) Stati di transizione, intermedi e selezione del meccanismo di folding.
La comprensione dei processi di folding delle proteine richiede una caratterizzazione strutturale di tutti gli stati conformazionali popolati durante il processo. E' chiaro però che mentre la struttura dello stato nativo di una proteina può essere determinata a livello atomico attraverso diverse metodiche (e.g. diffrazione dei raggi X di cristalli proteici, NMR in soluzione), la eterogeneità strutturale dello stato denaturato e/o la natura transiente degli stati di transizione e degli stati intermedi ne impedisce una caratterizzazione altrettanto dettagliata. Questo sottoprogetto è quindi focalizzato alla descrizione, a livello di residui amminoacidici e delle interazioni che tra di essi si stabiliscono, della struttura degli stati di transizione e degli stati intermedi nei due sistemi sperimentali modello utilizzati, sia tramite un approccio sperimentale (U.R. Roma) che teorico (in collaborazione con la U.R. Padova).
Dominio PDZ. La costruzione, nel nostro laboratorio, di due varianti (pseudo-wt Y43W e F14W) contenenti residui di Trp, altrimenti assenti nelle sequenze di questi domini, hanno permesso di condurre esperimenti di denaturazione all'equilibrio e di cinetica di folding in spettroscopia di fluorescenza. I risultati ottenuti hanno già portato alla identificazione, nel percorso di denaturazione di questo piccolo modulo strutturale, di due stati di transizione (TS1 e TS2) (21). Il presente sottoprogetto si propone di delineare la struttura di TS1 e TS2 del dominio PDZ tramite phi-value analysis. Il raggiungimento di questo obbiettivo permetterà di distinguere tra modelli alternativi di folding che vengono selezionati sulla base delle proprietà strutturali degli stati di transizione: un meccanismo di tipo "nucleazione-condensazione" o un meccanismo di tipo "diffusione-collisione". Successivamente alla definizione del meccanismo di folding ed alla descrizione strutturale dei due stati di transizione ci proponiamo di studiare il meccanismo del legame del dominio PDZ a peptidi con sequenza di riconoscimento consenso. L'ipotesi interessante che si vuole verificare riguarda la possibilità che residui amminoacidici ed interazioni chiave per il meccanismo di folding siano anche rilevanti per il meccanismo di legame e quindi per la funzione del dominio PDZ nella cellula (22). Si deve ricordare infatti che questo dominio strutturale è presente in diverse proteine dove è responsabile del riconoscimento proteina-proteina in diversi contesti cellulari (23-24).
Primo anno. Costruzione di mutanti sito-specifici a partire dai due pseudo-wt, Y43W e F14W. La caratterizzazione della cinetica di folding di mutanti che mappano su tutta la struttura di PDZ e la relativa analisi del valore phi permetterà la descrizione strutturale di TS1 e TS2 e la definizione del meccanismo di folding.
Secondo anno. Ci proponiamo di studiare la reazione di legame del dominio PDZ con piccoli peptidi sintetici (6-8 aminoacidi) con sequenza consenso di riconoscimento. La disponibilità di due varianti contenenti residui di Trp in posizioni diverse potrebbe permettere di seguire la reazione bi-molecolare di legame con il peptide registrando la variazione di fluorescenza intrinseca. Nel caso in cui non fosse possibile ottenere questo risultato (nessuna variazione del segnale a seguito del legame con il peptide), verranno utilizzati peptidi sintetici marcati con sonde fluorescenti (e.g. dansile) al fine di sfruttare la fluorescenza estrinseca. Ottenimento delle costanti di dissociazione per i due pseudo-wt e per i mutanti precedentemente utilizzati per caratterizzare gli stati di transizione per il processo di folding. Descrizione dello stato di transizione per la reazione di legame e confronto con gli stati di transizione della reazione di folding.
Citocromi c. Per quanto riguarda la famiglia dei citocromi c abbiamo avanzato l'ipotesi che a dettare il meccanismo di folding siano le proprietà topologiche, comuni a tutta la famiglia indipendentemente dalla distanza evolutiva, mentre le proprietà chimico-fisiche sequenza-specifiche siano responsabili della modulazione della stabilità degli stati di transizione e dello stato intermedio. Questa ipotesi, formulata su basi sperimentali, verrà verificata anche tramite esperimenti di dinamica molecolare e/o MonteCarlo offrendo in tal modo un ottimo banco di prova per queste metodiche. Gli obiettivi specifici che ci si propone di raggiungere con questo sottoprogetto riguardano: i) la caratterizzazione strutturale degli stati transienti da affrontare attraverso la caratterizzazione cinetica di diversi mutanti sito-specifici, ii) la verifica della possibilità di alterare il meccanismo di folding su basi razionali, e iii) la definizione del ruolo del cofattore (Fe-protoporfirina IX) nel processo di folding.
Primo anno. Caratterizzazione strutturale degli stati transienti. Questo risultato sarà raggiunto tramite esperimenti di cinetica rapida condotti su mutanti sito-specifici del citocromo c551 da P.aeruginosa che mappano in diverse regioni della proteina. L'ipotesi che si vuole studiare riguarda il ruolo centrale giocato dal motivo strutturale, estremamente conservato nei citocromi c, rappresentato dalla interfaccia tra le eliche N- e C-terminali. Le mutazioni sito-specifiche che ci proponiamo di ingegnerizzare riguarderanno non solo la delezione di alcune interazioni terziarie chiave, ma anche la alterazione delle proprietà di stabilità e propensità delle alfa-eliche terminali. In questo modo ci proponiamo di verificare l'ipotesi che l'intermedio parzialmente strutturato che si forma nella scala temporale dei millisecondi sia stabilizzato da questi elementi di struttura secondaria. Una ipotesi alternativa riguarda la possibilità che il grado di impaccamento interno della proteina controlli non solo la stabilità dello stato nativo ma anche la stabilizzazione dello stato intermedio. Questa ipotesi verrà verificata tramite la caratterizzazione della cinetica di folding di mutanti del citocromo c551 da P.aeruginosa progettati sulla base del citocromo c552 da H. thermophilus, la cui struttura presenta un ridotto numero di cavità interne. Questa strategia ci permetterà di studiare la possibilità di alterare il meccanismo di folding di una proteina, aprendo in questo modo l'interessante prospettiva di alterare, ed eventualmente correggere, anche i processi di folding errato nella cellula (vedi U.R. Firenze).
Un altro aspetto, attualmente poco chiarito, del meccanismo di folding del citocromo c c551 da P.aeruginosa riguarda il numero insolitamente alto di mutanti che presentano valori di phi maggiori di 1. Ci si propone di indagare, anche con l'aiuto di metodi computazionali avanzati (in collaborazione con la U.R. Padova), se questi residui stabiliscano delle interazioni chiave nella selezione di percorsi di folding paralleli, alla luce di quanto proposto da altri gruppi di ricerca e suggerito da alcuni nostri risultati noi (25,26).
Secondo anno. Definizione del ruolo del gruppo eme nel processo di folding dei citocromi c. Caratterizzazione delle proprietà termodinamiche e cinetiche del folding della forma apo (senza gruppo eme) del citocromo c552 di H. thermophilus: a causa della sua stabilità è infatti possibile che la forma apo di questa proteina mantenga un certo grado di organizzazione strutturale. La procedura sperimentale che permette di rompere i legami tioetere che legano il gruppo eme ai due residui di cisteina del motivo Cys-Xaa-Xaa-Cys è già stata messa a punto nel nostro laboratorio su altri citocromi c. Sarà interessante verificare l'ipotesi che lo stato intermedio previsto dal meccanismo di folding del citocromo c552 nella forma olo (con gruppo eme covalentemente legato) rifletta la organizzazione strutturale dell'apo-citocromo c552. La descrizione del meccanismo di folding dell'apo-citocromo c costituirà un avanzamento importante nella comprensione del folding di questa classe di proteine e permetterà di collegare le osservazioni compiute in vitro con i processi di biogenesi e di maturazione nella cellula.