RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Biologia strutturale e dinamica di proteine redox

Università di riferimento

Università degli Studi di ROMA "La Sapienza" - CHIMICA - ROMA(RM)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Alfredo DI NOLA

Descrizione

INTRODUZIONE

Scopo del presente progetto di ricerca è lo studio della struttura, della dinamica,della termodinamica e delle proprietà elettroniche di proteine redox per mezzo di metodi teorici e computazionali. Nell'ambito dei precedenti PRIN abbiamo stabilito attive collaborazioni con altre unità di ricerca (UO) presenti in questo progetto ed è nostro proposito continuare nelle ricerche intraprese. In particolare abbiamo ricerche in comune con l'UO-4 per lo studio della mioglobina e dei citocromi, con l'UO-5 per lo studio di un'antenna fotosintetica, il complesso Proteina-Clorofilla-Peridinina (PCP), l'UO-1 per lo studio della Glutammato Sintasi.



Queste collaborazioni hanno prodotto pubblicazioni comuni nelle quali abbiamo evidenziato alcune caratteristiche strutturali e funzionali di queste proteine [3,5,11]. Inoltre, grazie alle stimolanti discussioni con gli altri gruppi, abbiamo sviluppato metodi teorici e computazionali di particolare interesse nello studio delle proteine redox.
Uno di questi è rappresentato da un nuovo metodo di meccanica quantistica, il "Perturbed Matrix Method" (PMM). Il PMM permette di calcolare le proprietà elettroniche di un centro quantistico immerso nel campo prodotto dall'ambiente molecolare circostante [1,2]. Con questo metodo abbiamo calcolato gli spettri elettronici della PCP e della mioglobina [3-5]. Nella superossidodismutasi (SOD) abbiamo calcolato l'energia libera del processo di trasferimento elettronico [6]. Recentemente il PMM è stato modificato per permettere il calcolo degli spettri vibrorotazionali ed è stato applicato al monossido di carbonio in soluzione [7].
Inoltre abbiamo sviluppato un metodo, basato sulla tecnica del "campionamento di dinamica essenziale" (EDS), per simulare il processo di folding/unfolding delle proteine. Questo metodo è stato applicato con successo alla molecola di Citocromo C [8,9].
Un altro sviluppo teorico riguarda l'estensione della "teoria dell'entropia quasi-Gaussiana" (QGE), sviluppata in collaborazione col gruppo del prof. Berendsen in Olanda, per predire la termodinamica del processo di folding/unfolding. Questo metodo è stato applicato con successo al Citocromo [10].

NELL'AMBITO DEL PRESENTE PROGETTO AFFRONTEREMO I SEGUENTI STUDI:

GLOBINE
(incollaborazione con l'UO-4)

L'UO-4 ha in progetto di effettuare misure di cristallografia tempo-risolta su alcuni mutanti della Mioglobina (Mb), sull'emoglobina (Hb) e sulla neuroglobina (Ngb). Lo scopo è di ottenere dati che possano caratterizzare la struttura e la dinamica di queste proteine e di verificare la teoria che presuppone la presenza di sottostati conformazionali nella regolazione della funzione. In collaborazione con questa unità abbiamo effettuato 80 ns di simulazione di dinamica molecolare della molecola di Mb..CO. I risultati hanno mostrato una correlazione tra la fluttuazione delle cavità, presenti nella matrice proteica, e la diffusione del ligando all'interno della proteina.
Nell'ambito del presente progetto abbiamo intenzione di effettuare simulazioni di dinamica molecolare della Mb nativa, del mutante Mb-YQR, della Mb..CO della Hb e della Ngb per confrontare la struttura e la dinamica di queste proteine.
Inoltre, utilizzeremo il PMM per predire lo spettro vibrazionale del monossido di carbonio nella Mioglobina. Infine vogliamo estendere il PMM per studiare la reazione di attacco/distacco del CO col ferro.

GLUTAMMATO SINTASI (GltS)
(in collaborazione con l'UO-1)

Le UO-1 hanno risolto le strutture cristallografiche della subunità alfa della glutammato sintasi NADPH-dipendente (NADPH-GltS) di Azospirillum brasilense, prototipo delle GltS batteriche e eucariotiche , e della forma ferredossina-dipendente (Fd-GltS) del cianobatterio Synechocystis, modello delle GltS ferredossina-dipendenti delle cellule fotosintetiche.
Nell'ambito del precedente progetto, utilizzando le coordinate atomiche della subunità alfa della NADPH-GltS in complesso con un analogo della L-Gln (la L-Metionina solfone) e con il substrato 2-ossoglutarato, la nostra unità ha prodotto alcune simulazioni di MD della molecola in soluzione, nelle forme libera e legata ai substrati naturali L-Gln e 2-ossoglutarato. I risultati hanno permesso di ottenere informazioni sulla conformazione del sito ammidotrasferasico cataliticamente competente e hanno dimostrato come, in soluzione, la struttura della proteina nella regione dell'imboccatura del tunnel dell'ammoniaca si rilassa rispetto alla struttura cristallografica permettendo così il passaggio dell' ammoniaca rilasciata dalla L-Gln nel tunnel e la sua diffusione attraverso il tunnel verso il sito del 2-ossoglutarato.
E' nostra intenzione proseguire lo studio intrapreso e di ampliarlo per: a) dimostrare quale sia l'influenza dei substrati e dello stato di ossidoriduzione dei cofattori sulle proprietà dei siti catalitici e del tunnel; b) studiare il meccanismo di conversione del 2-ossoglutarato in L-glutammato recentemente proposto sulla base della risoluzione della struttura della Fd-GltS ad alta risoluzione. I risultati dei calcoli saranno confrontati con i risultati sperimentali derivati dalle strutture cristallografiche, con i dati di diffrazione dei raggi x a basso angolo e con dati di funzionalità su forme selvatiche e mutanti delle GltS.

COMPLESSO PERIDININ-CLOROPHYL-PROTEIN(PCP)
(in collaborazione con l'UO-5)

Nell'ambito del precedente progetto, secondo i suggerimenti dell'UO-5, abbiamo studiato un'antenna fotosintetica: il complesso peridinina-clorofilla-proteina (PCP).
Abbiamo effettuato una simulazione di dinamica molecolare classica in soluzione e il calcolo delle proprietà elettroniche della clorofilla nel complesso in soluzione. Inoltre abbiamo esteso lo studio all'altro cromoforo presente nel complesso: la peridinina.
Sulla base dei risultati ottenuti, è nostra intenzione estendere lo studio di questo complesso, focalizzando l'attenzione allo all'effetto dei moti conformazionali della proteina su altre importanti proprietà elettroniche del cromoforo. In particolare effettueremo il calcolo dei momenti di transizione (modulo e verso) della clorofilla dentro la proteina. La conoscenza di tale grandezza risulta di fondamentale importanza non solo per la comprensione delle propeietà spettroscopiche, ma anche per affrontare lo studio dei meccanismi di 'energy transfer'.

CITOCROMI
(in collaborazione con l'UO-4)

In stretta collaborazione con l'UO-4 negli ultimi due anni abbiamo studiato un'altra classe di emoproteine redox, i Citocromi. Il punto di partenza delle nostre simulazioni è stato basato sui dati sperimentali delle loro ricerche, come sui dati riportati in letteratura. L'UO-1 ha studiato la denaturazione del Citocromo nativo e di alcuni suoi mutanti. Lo scopo era di chiarire il ruolo di alcuni residui nella struttura e nel folding e di studiare i contatti nativi di questa proteina. Abbiamo prodotto traiettorie di folding/unfolding della proteina nativa per studiare le caratteristiche strutturali degli stati intermedi durante il folding [8,9]. I risultati hanno mostrato che il folding e l'unfolding procedono lungo alcune direzioni ben determinate.
Nell'ambito del presente progetto abbiamo intenzione di studiare l'effetto di diverse condizioni chimico-fisiche (pH, temperatura, ecc.) sul processo di folding.

SUPEROSSIDODISMUTASI (SOD)

Nell'ambito del precedente progetto abbiamo calcolato l'energia libera del processo di trasferimento di elettrone nella SOD. In questo progetto vogliamo studiare l'effetto di mutazioni nel trasferimento elettronico nella SOD.

Fe-IDROGENASI
(in collaborazione con l'UO-5)

Le Fe-Idrogenasi (Fe-Hyd) sono i più efficienti catalizzatori per la produzione di H2 oggi noti, ed in effetti la capacità delle alghe verdi unicellulari di rilasciare H2 sotto illuminazione è stata considerata un fenomeno di grande interesse tecnologico ponendo le premesse per la produzione di energia dalle sorgenti più abbondanti e rinnovabili esistenti in natura: luce e acqua. Ciò nonostante, la struttura tridimensionale della proteina è ancora ignota. Per contro, le strutture 3-D della Fe-Hyd di D.desufuricans e C.pasteurianum sono disponibili alla risoluzione di 1.6 e 1.8 A. Poiché tutte le Fe-Hyd note mostrano una elevata omologia di sequenza, in particolare nella regione del sito attivo, le strutture note possono servire come base per la determinazione di quella algali. Nell'ambito del presente progetto ci proponiamo di effettuare simulazioni di modeling e Dinamica Molecolare in collaborazione con l'UO-5.


SVILUPPO DI NUOVI METODI TEORICI E COMPUTAZIONALI

Un ulteriore aspetto delle nostre ricerche riguarda lo sviluppo di nuovi metodi teorici e computazionali, utili nello studio delle proteine e in particolare delle proteine redox.
1. Il PMM, di cui si è già parlato, verrà esteso al calcolo della reazione di legame ligando-ferro nella Mioglobina.
2. Un altro progetto riguarda l'estensione della "teoria dell'entropia quasi-gaussiana" (QGE) per la valutazione quantitativa delle proprietà termodinamiche delle proteine.
3.Un terzo progetto riguarda il perfezionamento della tecnica di campionamento di dinamica essenziale per lo studio dei processi di folding.

Bibliografia

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A first-principle method to model perturbed electronic wavefunctions: the effect of an external homogeneous field.
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2. R. Spezia, M. Aschi A. Di Nola and A. Amadei
Extension of the Perturbed Matrix Method: application to a water molecule.
Chem. Phys. Lett. 365,450-456 (2002).
3. R. Spezia, M. Aschi, A. Di Nola, M. Di Valentin, D. Carbonera and A. Amadei
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