RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

INTERAZIONE TRA PROTEINE CITOPLASMATICHE E MEMBRANE: STUDIO DELLA LIPOSSIGENASI COME SISTEMA MODELLO IN VITRO E IN VIVO.

Università di riferimento

Università degli Studi di ROMA "Tor Vergata" - MEDICINA SPERIMENTALE E SCIENZE BIOCHIMICHE - ROMA(RM)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Alessandro FINAZZI AGRO'

Descrizione

Gli obiettivi principali dell'U.R. n.1 saranno la caratterizzazione dei cambiamenti conformazionali dell'enzima indotti dall'interazione con i substrati, le modifiche strutturali dei doppi strati lipidici e la determinazione dell'eventuale ripartizione delle lipossigenasi tra domini e raft di membrana. Come sara' descritto piu' avanti, questa ricerca sara' portata avanti in tre fasi. La prima fase sara' dedicata ai campioni gia' disponibili (mini-LOX, apo-mini-LOX e LOX-1) e ai problemi collegati ai loro possibili stati d'aggregazione. In un secondo tempo verranno caratterizzati quegli enzimi preparati dall'U.R. di Teramo, aventi l'atomo di ferro sostituito con un altro metallo. Infine, nell'ultima fase, saranno studiati gli effetti delle lipossigenasi su membrane sintetiche e naturali. Un secondo compito dell'U.R. n.1 sara' l'espressione e la purificazione dell'enzima di mammifero, ed in particolare di quello di coniglio e di quello umano, di cui sara' anche possibile progettare e realizzare mutanti da utilizzare come strumenti d'indagine di base per patologie collegate alla famiglia delle lipossigenasi. Questa attivita' di ricerca parallela, sara' anche sviluppata in tre fasi distinte.
Alla fine d'ogni fase, sara' effettuato un riesame del programma dell'U.R. n.1, sulla base del confronto tra i risultati parziali attesi e ottenuti.

Fase 1
a. "Folding" e stabilita' della mini-LOX e dell'apo-mini-LOX
In questa prima parte del nostro programma studieremo in maggiore dettaglio il processo di folding della mini-LOX, misurando anche la stabilita' della forma apo, prodotta dall'U.R. n.2, utilizzando classiche misure di spettroscopia di fluorescenza e di dicroismo circolare all'equilibrio. A questo proposito, le apparecchiature a disposizione dell'U.R. n.1 sono due fluorimetri statici, (K2- ISS, Inc. Champaign, IL, and Fluoromax-3, Jobin Yvon), entrambi dotati di polarizzatori per misure di anisotropia, e uno spettropolarimetro (Jasco J-700) per determinare i cambiamenti di struttura secondaria nel corso di esperimenti di denaturazione e rinaturazione. Per caratterizzare in maggior dettaglio il processo di folding della mini-LOX, saranno portati avanti studi cinetici di denaturazione e rinaturazione. In particolare, misure di fluorescenza e dicroismo circolare saranno effettuate con i fluorimetri e lo spettropolarimertro gia' citati, recentemente implementati con due apparti accessori per la cinetica rapida (rispettivamente SFA-20, Hi-Tech, e SFM-20, Bio-Logic).
Un altro problema che sara' analizzato in questa prima parte del programma, in collaborazione con l'U.R. n.3, e' quello dell'aggregazione delle lipossigenasi in differenti condizioni sperimentali, quali la concentrazione proteica, la forza ionica e la temperatura. In particolare l'aggregazione dei vari campioni di mini-LOX sara' preliminarmente rivelata mediante un analizzatore dinamico di particelle (Horiba LB-550). Una volta determinate le condizioni d'aggregazione, i campioni verranno suddivisi in due aliquote, una delle quali sara' inviata all'U.R. n.3 per le misure di light scattering dinamico, mentre l'altra sara' esaminata mediante spettroscopia CD e di fluorescenza per studiare i cambiamenti conformazionali subiti dalla proteina a causa dell'aggregazione. Le due U.R. (n.1 e n.3) effettueranno anche simultaneamente misure in funzione del tempo, per studiare gli effetti dell'invecchiamento sul fenomeno dell'aggregazione.

b. Clonazione dei geni di lipossigenasi di coniglio e umana
L'mRNA sara' rispettivamente purificato da cellule di coniglio e da monociti umani primari, precedentemente trattati con interleuchina-13, e soggetto a RT-PCR per ottenere il cDNA codificante i geni della lipossigenasi di mammifero. Il cDNA sara' clonato e sequenziato come controllo.

Fase 2
a. Dinamica conformazionale dell'interazione lipossigenasi-ligandi
In questa seconda parte del progetto, l'obiettivo principale dell'U.R.the n.1 sara' lo studio della stabilita' e della dinamica conformazionale dei campioni preparati dall'U.R. n.2, sostituendo il ferro con altri metalli. Misure di denaturazione/rinaturazione delle varie proteine saranno effettuate secondo le modalita' gia' descritte nella Fase 1. L'analisi della dinamica d'interazione delle proteine con i ligandi sara' invece realizzata con metodologie di fluorescenza dinamica. In particolare, sara' usata la tecnica di fase e demodulazione per misurare le vite medie di fluorescenza e i tempi di correlazione rotazionale dei campioni in soluzione. L'U.R. n.1 dispone di un fluorimetro dinamico (Koala-ISS), dotato di quattro diodi laser, sia per l'eccitazione nella regione dell'UV (cioe' a 280 e 300 nm), sia nel visibile (cioe' 370 e 450 nm). I campioni verranno quindi studiati sia monitorando il segnale di fluorescenza intrinseca, sia l'emissione di fluorofori estrinsechi, come l'1-anilinonaftalene-8-sulfonato (ANS) e il 5-dimetilaminonaftalene-1-sulfonil cloruro (dansile cloruro). Inoltre, saranno utilizzati inibitori che simulano il legame dei substrati naturali delle lipossigenasi, marcati con apposite molecole fluorescenti, in modo da poter sfruttare l'effetto di trasferimento non radiativo dai residui triptofilici della proteina. In questo modo, il trasferimento d'energia di fluorescenza (FRET) potra' essere utilizzato per misurare variazioni di distanze intramolecolari e dunque monitorare i cambiamenti conformazionali che caratterizzano il processo d'interazione proteina-ligando. Le proprieta' elastiche delle lipossigenasi e del complesso lipossigenasi-ligando saranno caratterizzate misurando la compressibilita' isoterma dei campioni ed i cambiamenti di volume associati, fino a 3000 e/o 4000 bar, a varie temperature.

b. Espressione del cDNA della lipossigenasi di coniglio e umana
Il cDNA codificante per il gene della lipossigenasi di coniglio e di quella umana sara' espresso rispettivamente in E. Coli e nel sistema cellulare baculovirus/insetto, dato che esistono gia' procedure di purificazione per gli enzimi wild type. Forme mutanti della proteina saranno ottenute mediante sistemi di mutagenesi disponibili in commercio.


Fase 3
a. Analisi dell'interazione lipossigenasi-membrane e degli effetti delle lipossigenasi sulla struttura lipidica
Gli effetti dinamici e strutturali del legame della LOX, mini-LOX e dell'apo-mini-LOX con membrane modello, liposomi o vescicole lipidiche unilamellari giganti, saranno studiati usando sonde fluorescenti come il DPH e il Laurdan. In particolare, tali effetti saranno monitorati attraverso misure di distribuzione continue di vite medie di fluorescenza del DPH e mediante la determinazione di spostamenti spettrali del Laurdan, quantificabili con i valori della funzione di polarizzazione generalizzata (GP).
Saranno quindi utilizzati inibitori enzimatici per simulare la semplice interazione dell'enzima con le membrane in assenza di attivita' catalitica, mentre con le medesime tecniche sara' possibile verificare danni strutturali causati alle membrane stesse in seguito all'attivita' ossidativa dei vari enzimi. I risultati verranno quindi paragonati a quelli ottenuti dall'U.R. n.2 mediante spettroscopia FTIR per ottenere un quadro d'unione completo.
Globalmente, seguendo l'attivita' delle lipossigenasi e la loro interazione con i lipidi, questi esperimenti serviranno a determinare modificazioni i) della dinamica dei lipidi di membrana; ii) della costante dielettrica di membrana che e' infatti correlata alla penetrazione di molecole d'acqua in seguito alla idroperossidazione dei lipidi; e iii) dei domini lipidici caratterizzati da fasi diverse.
Come obiettivo finale, sara' affrontata la verifica dell'esistenza d'eventuali coefficienti di ripartizione superficiale delle lipossigenasi (ed eventualmente anche di loro stati aggregati) tra rafts e/o differenti domini di membrana, grazie anche alle misure effettuate dall'U.R. n.3 con il microscopio a forza atomica.


b. Purificazione dei campioni
In quest'ultima parte del progetto saranno purificate le lipossigenasi ricombinanti e i loro mutanti. I campioni saranno dunque pronti per essere caratterizzati strutturalmente e funzionalmente in collaborazione con le U.R. n.2 e n.3.

Potenziamento e aggiornamento dell'apparato strumentale
Come risulta dalle sezioni precedenti, la strumentazione di fluorescenza dinamica svolgera' un ruolo di primo piano nello sviluppo del progetto dell'U.R. n.1. Di conseguenza abbiamo previsto di aggiornare l'elettronica del fluorimetro dinamico, sostituendo la vecchia scheda con circuiti di acquisizione dati piu' nuovi e piu' veloci. Anche il sistema di rivelazione elettro-ottico sara' migliorato, acquistando una nuova coppia di fotomoltiplicatori ad alta sensibilita' e il nuovo software sviluppato dall'ISS. Una nuova cella a pressione dotata di finestre di zaffiro sara' aggiunta al sistema per estendere le misure fino a 4000 bar.
Infine, sara' necessario l'acquisto di un microscopio a fluorescenza per lo studio delle membrane.