RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

INTERAZIONE TRA PROTEINE CITOPLASMATICHE E MEMBRANE: STUDIO DELLA LIPOSSIGENASI COME SISTEMA MODELLO IN VITRO E IN VIVO.

Università di riferimento

Università Cattolica del Sacro Cuore - Fisica - MILANO(MI)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Giuseppe ARCOVITO

Descrizione

Verranno usate le diverse forme di lipossigenasi: LOX-1, mini-LOX, apo-mini-LOX anche ricostituita con diversi metalli per: i) determinare la cinetica della loro aggregazione; ii) caratterizzare gli aggregati formati; iii) studiare le caratteristiche della interazione delle forme monomeriche e degli aggregati con membrane sintetiche e con membrane naturali, con particolare riferimento all'interazione con le fasi raft e non-raft delle membrane.

1) Caratterizzazione degli aggregati di lipossigenasi di tipo 1 (LOX-1) di soia.

La cinetica di formazione degli aggregati di LOX-1 ed i parametri strutturali di tali aggregati saranno studiati al variare delle differenti condizioni fisico-chimiche. Combinando l'uso della diffusione elastica e quasi elastica della luce con immagini topologiche AFM e misure AFM di spettroscopia di forza (Witec), misureremo i parametri strutturali quali le dimensioni degli aggregati, la loro dimensione frattale, il modulo elastico locale e di insieme. Tutte queste misure saranno effettuate utilizzando enzimi prodotti e purificati dalla U.O. di Teramo. Si programma pertanto una serie di misure SLS, DLS and AFM su LOX-1 in differenti condizioni di concentratione dell'enzima, di temperatura, di forza ionica, in parallelo con le condizioni sperimentali studiate dall' U.O. di Teramo.
Misure di Light Scattering Statico e Dinamico effettuate utilizzando uno strumento commerciale (ALV, Langen, Germany) costitutito da un braccio rotante CGS-5000, un fotomoltiplicatore EMI-9863 (PMT), un correlatore digitale multi-tai ALV 5000 e da un laser a ioni di Argon (Coherent Innova 70) che produce un fascio di potenza 100 mW alla lunghezza d'onda di 488 nm. La cella di scattering è immersa in un liquido per minimizzare le variazioni di indice di rifrazione (Toluene) la cui temperatura può essere controllata con una precisione di ±0.1°C. Tipicamente misure di SLS a DLS sono effettuate simultaneamente e analizzate con programmi ad hoc. Per ciascun campione si acquisscono dati a diversi angoli, da 20° a 150°, per studiare dimensioni spaziali che vanno da 1 nm ad 1 um.
Immagini di AFM saranno acqusite utilizzando l'SPMagic SX Atomic Force Microscopy (Elbatech, Italy). Le mappe tridimensionali del campione sono generate registrando la posizione del campione richiesta per mantenere costante l'ampiezza di oscillazione. Il sensore del microscopio è una levetta di arsenurio di silicio di costante elastica nominale pari a k=40N/m, e con un raggio della punta minore di 10nm (NSC16/50 MikroMash). Le analisi delle immagini sono effettuate con il programma WSxM (Nanotec Electronica S.L., Spain).
La tecnica AFM permette di misurare dimensioni sino alla regione dei millimetri e pertanto è un tecnica complementare, per grandi dimensioni, alla diffusione elastica della luce (SLS and DLS). I risultati saranno combinati con quelli ottenuti dalla U.O. di Teramo che utilizza tecniche di scattering di raggi X a basso angolo (SAXS) e che si riferiscono a dimensioni nell'intervallo 0.01-1 nm. In questo modo otterremo informazioni in un intervallo di dimensioni di circa tre decadie ottenere i parametri caratterizzanti le diverse lipossigenasi e i loro aggregati (ad esempio la dimensione frattale).
Quando sarà disponibile l'estensione dell'AFM alla spettroscopia di forza, le immagini saranno acquisiste in tapping mode, e saranno determinate le proprietà elastiche (i.e. modulo di Young, flessibilità etc.) degli aggregati di LOX-1. E' utile notare che poiche in tapping mode la punta non è in diretto contatto con la superficie del campione e produce forze laterali trascurabili, migliorando notevolmente la qualità delle immagini.
Dall'insieme delle misure che si prevede di effettuare verrà definito il contributo delle interazioni idrofobiche e polari tra le molecole di enzima.

2) Determinatione e caratterizzazione di aggregati di mini-LOX (dominio C-terminale di LOX-1)

A seguito della parziale proteolisi della LOX-1 di soia è stato isolata la regione C-terminale, detta mini-LOX, di peso molecolare di 60 kDa. E' stato dimostrato che la mini-LOX ha una struttura propria ed una attività catalitica maggiore dell'enzima intatto. Misure preliminari (U.O. di Teramo) inoltre suggeriscono che è possibile eliminare dalle mini-LOX il ferro, aprendo pertanto la possibilità di studiare l'apo-enzima e forme ricostituite con diversi metalli. Inoltre la mini-LOX mostra una più alta affinità con le membrane rispetto alla LOX-1. Questo aumentato carattere idrofobico della mini-LOX è attribuibile all'aumento della superficie idrofobica esposta dopo la rimozione del frammento N-terminale di peso molecolare pari a 30 kDa. Sulla base di queste evidenze possiamo ipotizzare che mini-LOX abbia una propensione all'aggregazione maggiore di LOX-1. Pertanto programmiamo di ripetere l'insieme delle misure SLS, DLS and AFM precedentemente descritte per questa variante dell'enzima. Da queste misure si pensa di poter definire se uno specifico stato di aggregazione è all'origine della maggiore attività catalica della mini-LOX. Anche in questo caso le nostre misure saranno combinate con quelle ottenute dagli esperimenti SAXS della U.O. di Teramo.
Infine, lo studio della apo-mini-LOX permetterà di verificare l'influenza della presenza del ferro o di altri metalli sulla formazione di aggregati e sulla loro struttura.


3) Caratterizazione delle interazioni tra le diverse lipossigenasi e membrane sintetiche e naturali.

Il legame delle LOXs, ottenute da vegetali e da mammiferi, con doppi strati lipidici è modulato dalla presenza di calcio. Inoltre, la maggiore affinità della mini-LOX per le membrane rispetto all'enzima nativo può essere imputata all'aumento della superficie idrofobica esposta a seguito della rimozione del frammento N-terminale. Nello studio delle interazioni tra lipossigenasi e membrane, allo scopo di isolare la prima fase di interazione tra le lipossigenasi e le membrane dalla seconda fase di attività catalitica, intendiamo utilizzare specifici inibitori, reversibili o irreversibili.
Si stanno ottenendo sempre maggiori evidenze sul coinvolgimento di microdomini lipidici (raft) in processi di signalling e di regolazione del protein trafficking. La tecnica AFM si è dimostrata un ottimo strumento per la risoluzione spaziale dei raft. I nostri studi sull'interazione tra le lipossigenasi e le membrane riguarderanno: 1) la determinazione di una eventuale ripartizione delle diverse forme di lipossigenasi tra le fasi raft e non-raft; 2) lo studio della forza di interazione tra: 2.1) membrane modello; e 2.2) membrane cellulari. Le membrane modello saranno formate da opportune miscele lipidiche in modo da ottenere domini raft e domini non-raft. Le membrane cellulari saranno costituite da intere cellule di macrofagi primari adesi sul supporto per le misure AFM. L'interazione di questi campioni, sintetici e naturali, con le diverse forme di lipossigenasi sarà studiata nel seguente modo: gli enzimi saranno legati covalentemente alla punta del microscopio tramite reazioni avidina-biotina; la forza di interazione tra l'enzima e le varie aree dei lipidi sarà determinata attraverso la scansione x-y. Data la risoluzione spaziale di questa procedura, la forza di interazione sarà correlata alla presenza di raft o di zone specifiche delle membrane cellulari.

Per la realizzazione dei punti 2 e 3 del programma di ricerca sarà critica l'acquisizione dello strumento per la spettroscopia di forza (Witec) da utilizzare a complemento dell'AFM. Infatti questo permetterà di estendere le nostre osservazioni alla determinazione dei parametri di visco-elasticità necessari per comprendere la relazione tra struttura ed attività delle lipossigenasi e la natura delle interazioni con le membrane.