RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Ottenimento di cellule embrionali staminali-simili coltivando fibroblasti in presenza di estratti di cellule embrionali staminali di topo

Università di riferimento

Università degli Studi di PAVIA - BIOLOGIA ANIMALE - PAVIA(PV)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Silvia GARAGNA

Descrizione

PIANO SPERIMENTALE

Il piano sperimentale qui descritto, i tempi di attuazione ed i metodi impiegati sono stati sviluppati in seguito a una serie di esperimenti preliminari che abbiamo effettuato e che sono descritti nei 'Risultati Preliminari' (Modello A, 2.3). I risultati di questi esperimenti fortemente suggeriscono che gli estrati di cellule embrionali staminali sono in grado di riprogrammare cellule somatiche differenziate.

Cellule ES saranno preparate da blastocisti ottenute sia per fecondazione in vitro che per accoppiamento naturale di topi F1B6C3 (pelo nero). Fibroblasti fetali, ottenuti da embrioni allo stadio di 13.5 giorni di sviluppo, verranno impiegati come cellule somatiche da riprogrammare. Inoltre verranno impiegate cellule ES femminili e fibroblasti maschili, poiche' la presenza del cromosoma Y permettera' l'identificazione genotipica delle cellule riprogrammate nei nostri esperimenti.

Le procedure utilizzate per la fecondazione in vitro, la coltura di embrioni, l'isolamento e la coltura di cellule ES sono routinariamente impiegate nel laboratorio del responsabile di questa Unita' di ricerca.

Per raggiungere gli obiettivi del programma di ricerca proposto, il lavoro procedera' attraverso i seguenti 6 stadi:

1) Blastocisti ottenute per fecondazione in vitro e accoppiamento naturale verranno impiegate per l'isolamento della massa cellulare interna dalla quale verranno prodotte linee di cellule ES.

2) Preparazione di estratti cellulari da cellule ES.
La preparazione di estratti cellulari ('cell-free') ottenuti per omogenizzazione di cellule ES (vedi METODI) e l'analisi della loro tossicita' si basera' sul protocollo messo a punto da Hakelien et al. (2002). Poiche' le cellule ES non sono mai state usate prima per la preparazione di estratti cellulari in esperimenti di riprogrammazione, noi abbiamo gia' effettuato degli esperimenti preliminari che hanno messo in evidenza la necessita' di cambiamenti al protocollo originale al fine di adattarlo a questo tipo cellulare (per i dettagli si veda il capitolo METODI).

3) Permeabilizzazione delle membrane dei fibroblasti ed esposizione all'estratto cellulare da cellule ES.
La membrana dei fibroblasti sara' permeabilizzata, esposta agli estratti di ES e richiusa. I fibroblasti cosi' riprogrammati saranno ulteriormente coltivati (T0 del processo di riprogrammazione). Il tempo di esposizione sara' di 1 ora come suggerito da Hakelien et al. (2002) e dai nostri esperimenti preliminari che hanno messo in evidenza l'efficacia di questo protocollo per riprogrammare i fibroblasti anche quando l'estratto cellulare e' stato ottenuto da cellule ES. Comunque, intendiamo anche utilizzare un tempo di esposizione di 30 minuti. Un tempo di esposizione piu' lungo e' gia' stato utilizzato e si e' dimostrato deleterio per la sopravvivenza cellulare.

4) Coltura dei fibroblasti riprogrammmati.
Saranno effettuati tre tipi di esperimenti:

a) dopo esposizione agli estratti di cellule ES, i fibroblasti saranno coltivati in un terreno di coltura ottimale per la crescita delle cellule ES (terreno ES);

b) fibroblasti non permeabilizzati sarannno coltivati in estratti di cellule ES per 30 o 60 minuti e quindi coltivati in terreno ES (controllo della necessita' della fase di permeabilizzazione);

c) fibroblasti permeabilizzati e richiusi, ma non coltivati in presenza di estratti cellulari di cellule ES, saranno coltivati in terreno ES (controllo per la necessita' della coltura in presenza di estratti da cellule ES).

A tempi di intervallo definiti (ogni 48 ore da quando le cellule verranno ripiastrate e per un periodo di 21 giorni), aliquote di cellule ottenute da questi esperimenti saranno analizzate applicando saggi in situ ed extra situm. Campioni di fibroblasti riprogrammmati verranno coltivati per analizzare la loro capacita' di mantenere lo stato di pluripotenzialita' nel tempo.

Nei nostri esperimenti preliminari, abbiamo coltivato i fibroblasti riprogrammati in un terreno di coltura adatto alla crescita dei fibroblasti. Questi esperimenti hanno messo in evidenza che questo tipo di coltura non e' adatto; infatti, sebbene alcune cellule abbiano formato delle colonie simili a quelle formate dalle cellule ES, queste si moltiplicano molto piu' lentamente e tendono a riacquisire la morfologia del fibroblasto.

5) Analisi del processo di riprogrammazione
Al fine di definire lo stadio di riprogrammazione e l'acquisizione di una condizione simile a quella delle cellule ES, i fibroblasti riprogrammati saranno analizzati utilizzando metodi di biologia cellulare e molecolare. I risultati ottenuti costituiranno la richiesta di base per ulteriori analisi del processo di riprogrammazione.
Prima di iniziare qualsiasi tipo di analisi, e per accertarsi che le cellule analizzate derivino dai fibroblasti, campioni di fibroblasti riprogrammati saranno analizzati per la determinazione del sesso utilizzando tecniche sia di ibridazione in situ che di PCR.

a) Osservazione dei cambiamenti morfologici
Dai nostri esperimenti preliminari ci si attende che dopo 10-15 giorni di coltura, i fibroblasti modifichino la loro morfologia assumendo una organizzazione simile alle colonie di cellule ES (Figura 3A, B in Modello A). Il numero delle colonie formate per piastra sara' contato. Utilizzando il marker per la staminalita' SSEA-1, la percentuale di fibroblasti riprogrammati sara' determinata utilizzando il FACS.

b) Analisi del cariotipo
Il cariotipo dei fibroblasti verra' determinato all'inizio di ciascun esperimento di riprogrammmazione. Il cariotipo dei fibroblasti riprogrammati sara' determinato dopo 3 settimane e quindi ogni mese per una durata che coincidera' con il mantenimento delle caratteristiche dello stato di pluripotenza.

c) Formazione dei corpi embrioidi
La capacita' delle cellule ES-simili di moltiplicarsi, di formare colonie e di formare corpi embrioidi verra' utilizzata per definire l'acquisizione dello stato di cellule ES-simili.

d) La capacita' dei fibroblasti riprogrammati di partecipare alla formazione di un nuovo individuo ed alla colonizzazione della sua linea germinale verra' determinata iniettando cellule ES-simili nelle blastocisti di topi del ceppo CD1 (pelo bianco), che saranno successivamente trasferite nell'utero di una madre adottiva pseudogravida.

e) Saggio della fosfatasi alcalina
Aliquote di cellule ES simili saranno sottoposte costantemente alla analisi della presenza di questo marcatore della pluripotenza.

f) Attivazione e repressione di marcatori che definiscono la transizione da fibroblasti a cellule ES-simili.
Ad ogni intervallo di tempo (ogni 48 ore), campioni di cellule verranno prelevati per poter studiare l'espressione genica, la presenza di antigeni, la metilazione del DNA e l'architettura nucleare. Questi esperimenti verranno effettuati su fibroblasti, prima (controllo) e dopo (fibroblasti riprogrammati) la loro coltura in presenza di estratti cellulari di cellule ES. Inoltre, gli stessi esperimenti verranno condotti su cellule ES (controllo).

Analisi della presenza di marcatori specifici sia della condizione di staminalita' che dei fibroblasti.


Architettura nucleare
Utilizzando metodiche di immunocitochimica (anticorpi contro le proteine centromeriche e l'HP1-alfa) e di ibridazione in situ luorescente (FISH) (sonde specifiche per il DNA satellite), verra' determinata la distribuzione e la posizione relativa della eterocromatina costitutiva (sia il DNA satellite che l'istone HP1-alfa) e dei centromeri.


METODI

1)Preparazione di estratti cellulari di cellule ES
Cellule ES vengono prodotte di routine (Figura 1), determinandone il sesso, nel laboratorio del Coordinatore della Unita' di Ricerca N.1. Estratti cellulari di cellule ES verranno preparati seguendo le indicazione di Hakelien et al. (2002), ma invece di lasciare le cellule nel tampone di lisi per 45 min, esse verranno sonicate immediatamente. I nostri esperimenti preliminari hanno mostrato che questo passaggio non e' necessario poiche' la capacita' riprogrammante dell'estratto non cambia. In breve, cellule ES verranno congelate in azoto liquito per 10 min, scongelate, lavate in tampone di lisi freddo e lasciate sedimentare. Il pellet verra' risospeso in 2 volumi di tampone di lisi, sonicato e centrifugato a 15000 g per 15 minuti a 4C. L'estratto cellulare verra' impiegato sia fresco che congelato. Abbiamo previsto di condurre alcuni esperimenti nei quali gli estratti verranno trattati con 100 µg/ml di DNasi I e 50 µg/ml di Rnasi A per eliminare la presenza di DNA genomico e di RNA, rispettivamente (Hakelien et al., 2002). Questi ultimi esperimenti permetteranno di ottenere informazioni sul ruolo svolto dagli acidi nucleici nei processi di riprogrammazione.

2) Permeabilizzazione della membrana cellulare dei fibroblasti e esposizione agli estratti
I fibroblasti fetali verranno dapprima lavati in PBS freddo e poi risospesi in HBSS. Aliquote di 100000 cellule verranno centrifugate, risospese in HBSS contenente streptolisina O e coltivate a 37C per 50 min. Dopo centrifugazione, le cellule verranno risospese in 100 µl di estratto di cellule ES contenente 'ATP-regenerating system' e NTPs e coltivate per 1 ora a 37 C. I fibroblasti verranno poi richiusi in terreno ES contenente 2 mM CaCl2 a 37C per 2-4 ore e, dopo centrifugazione, verranno risospesi in terreno ES e coltivati.

3) Analisi del cariotipo
Un'ora dopo l'esposizione al colcemid, le cellule verranno trattate con 0,56% KCl a 37 C per 10 min., centrifugate e fissate in metanolo:acido acetico (3:1 v/v) per 30 min a 4 C. L'ultimo passaggio verra' ripetuto due volte, quindi le cellule verranno fatte cadere su un vetrino e asciugate all'aria. Il numero di cromosomi verra' determinato dopo colorazione con 5% Giemsa.

4) Formazione di corpi embrioidi
Cellule ES-simili e cellule ES verranno rimosse dalle capsule di coltura con un trattamento con tripsina, verranno centrifugate a 800 rpm per 10 min. e risospese in terreno ES completo senza LIF. 2000 cellule verranno piastrate in piccole gocce sul coperchio di capsule Petri e coltivate in sospensione. Dopo 5 giorni di coltura, e' attesa la formazione di corpi embrioidi.

5) Capacita' dei fibroblasti riprogrammati di partecipare alla formazione di un nuovo individuo ed alla colonizzazione della sua linea germinale.
Cellule ES-simili, con cariotipo maschile, verrano iniettate mediante micromanipolazione, in blastocisti a cariotipo femminile, precedentemente determinato grazie al prelievo, sempre con il micromanipolatore di una porzione di trofectoderma. Le cellule del trofectoderma verranno analizzate con PCR per la presenza dei geni Sry e Zfy (presenti sul cromosoma Y) e Dxn (presente sul cromosoma X). Il cromosoma Y, utilizzato come marcatore genotipico delle cellule ES-simili verra' messo in evidenza impiegando tecniche di FISH (whole chromosome painting) in alcuni tessuti somatici e nelle gonadi.

6) Caratterizzazione dell'architettura nucleare
Le cellule verranno centrifugate, desposte su un vetrino e fissate in 4% paraformaldeide in PBS per 10 min, cosi' da conservare la tridimensionalita' del nucleo. Dopo la fissazione verranno analizzate le regioni:

a) di eterocromatina costitutiva:
sonde in grado di ibridare il DNA satellite maggiore e minore verranno impiegate per evidenziare le regioni AT-ricche del DNA satellite localizzate nelle regioni pericentromeriche di tutti i cromosomi di topo. I nuclei verranno denaturati in 70% formammide, 2XSSC a 70º C per 2 minuti. Dopo la denaturazione della sonda, la soluzione di ibridazione verra' applicata sui vetrini e l'ibridazione avverra' a 37º C per una notte. I lavaggi di post-ibridazione verranno eseguiti in 50% formamide in 2XSSC a 38º C per 5 minuti ciascuno. I segnali di ibridazione verranno rilevati con avidina coniugata con FITC. I nuclei verranno poi contro-colorati con DAPI e montati con un soluzione "antifading".
Le regioni di eterocromatina costitutiva verrano anche localizzate utilizzando l'anticorpo HP1-alfa. I vetrini verranno incubati per 30 min a 37 C con anticorpi commerciali. Dopo tre lavaggi in PBS, i vetrini verranno incubati per 45 min a 37C con IgG di capra anti-umane coniugate con FITC. I nuclei verranno contro-colorati con Hoechst 33258.

b) Centromeriche: i cinetocori verranno rilevati con una reazione di immunofluorescenza indiretta impiegando anticorpi anti-centromero umani (CREST serum, Sigma). I campioni verranno analizzati con un microscopio a fluorescenza (Olympus Provis) corredato di una telecamera CCD (Photometrics CH300) e con un microscopio confocale (Leica TCS SP).

7) Analisi della presenza di marcatori
L'analisi della espressione di marcatori specifici verra' condotta ad intervalli di tempo (ogni 48 ore) dall'inizio dell'esposizione dei fibroblasti agli estratti di cellule ES utilizzando metodiche immunocitochimiche.
Come marcatori della pluripotenzialita' verrano utilizzati gli anticorpi per: OCT-4, SSEA-1, antigene di Forssman.
Come marcatori specifici per i fibroblasti si utilizzeranno anticorpi contro: Protocollagene Tipo I alfa 1 e alfa 2; N-caderina.


BIBLIOGRAFIA

- Hakelien AM, Landsverk HB, Robl JM, Skalhegg BS, Collas P. Reprogramming fibroblasts to express T-cell functions using cell extracts. Nat Biotechnol 20: 460-466, 2002.

- Zuccotti M., Sebastiano V., Garagna S., Redi CA. Experimental demonstration that Mammalian oocytes are not selective towards X- or Y-bearing sperm. Molec Reprod Dev. 2005. In press.