RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Ottenimento di cellule embrionali staminali-simili coltivando fibroblasti in presenza di estratti di cellule embrionali staminali di topo

Università di riferimento

Università degli Studi di PARMA - MEDICINA SPERIMENTALE - PARMA(PR)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Maurizio ZUCCOTTI

Descrizione

A ciascun intervallo di tempo (ogni 48 ore) campioni preparati dall'Unita' di Ricerca N.1, saranno sottoposti all'analisi dell'espressione genica e della metilazione del DNA. Questi esperimenti saranno effettuati sulle cellule ES stesse (controllo) e su fibroblasti, prima (controllo) e dopo (cellule ES-simili) la loro coltura in presenza di estratti di cellule ES.


ANALISI DELLA ESPRESSIONE GENICA

Analisi quantitativa del profilo di espressione di geni marcatori del processo di riprogrammazione.
- Geni specifici delle cellule ES: Oct-4, Rex-1 e Nanog.
- Geni specifici dei fibroblasti: Col1a1, Col1a2 e FSP1/S100a4.
L'espressione genica sara' analizzata a specifici intervalli di tempo (ogni 48 ore), in seguito all'esposizione di fibroblasti all'estratto cellulare di cellule ES.

Isolamento dell'RNA e sintesi del cDNA
L'RNA verra' isolato e retrotrascritto in base al metodo descritto da Gentile et al. (2004). pAW109 RNA (Applera) sara' aggiunto a ciascun campione come controllo interno dell'efficienza delle reazioni di RT-PCR (Retro Transcriptase Polymerase Chain Reaction) ed utilizzato come standard per la determinazione del profilo quantitativo dei trascritti dei geni in studio.

PCR
Per ciascun gene verra' messa a punto una triplex PCR per la coamplificazinoe, in prima PCR, di tre sequenze geniche: il cDNA della sequenza del gene in studio, il cDNA di controllo usato per la quantificazione (pAW109) ed un gene endogeno di controllo (Hprt).

Quantificazione dei prodotti di PCR
I prodotti di amplificazione verranno sottoposti ad elettroforesi, quantificati utilizzando il sistema Bio-Rad Gel-Doc ed elaborati con il Bio-Rad Quantity One Software. Inoltre, in seguito alla retro-trascrizione, i campioni saranno anche analizzati con la procedura Taq-Man (Applera) che permette l'analisi in Real-Time del campione.


METILAZIONE DEL DNA DELL'INTERO GENOMA E DI GENI SPECIFICI

L'analisi della metilazione del DNA dell'intero genoma sara' effettuata utilizzando un anticorpo anti-5-metilcitosina. Sara' analizzato anche il profilo di metilazione delle isole CpG presenti nel promotore e nella regione 5' di Oct-4, Rex-1 e Nanog, sia utilizzando una 'methylation-sensitive PCR' che il metodo del bisulfito.

Analisi in situ
Le cellule saranno lavate dal terreno di coltura, centrifugate, fissate in metanolo:acido acetico freddo (3:1 v/v) e lasciate depositare su un vetrino. I vetrini saranno incubati in PBS contenente 3% di BSA per 20 min a 37 C al fine di bloccare siti di legame aspecifici, quindi incubati in anti-5-metilcitosina coniugata con FITC in PBS, 1% BSA per 60 min a 37 C. Successivamente a tre lavaggi in PBS i nuclei saranno colorati con Hoechst 33258 (0.2 µg/ml) per 5 min, lavati in PBS e montati con "antifading" (DABCO). Per escludere una disomogenea colorazione dell'anticorpo anti-5-metilcitosina dovuta ad una differenziale accessibilita' del DNA, i nuclei saranno colorati con un anticorpo anti-DNA.

Analisi extra-situm
In seguito all'estrazione di DNA, la metilazione dei siti CpG verra' studiata utilizzando sia il metodo della "restriction enzyme-sensitive PCR" che quello del "bisulfite genome sequencing".

"Restriction enzyme-sensitive PCR"
30 U di enzimi di restrizione sensibili alla presenza di metilazione verranno aggiunti al campione di DNA e incubati per 90 min a 37 C, e quindi inattivati al calore per 15 min a 95 C. Ventitre microlitri di miscela di PCR verranno aggiunti a ciascun campione di DNA. Gli oligonucleotidi verranno scelti in modo che la sequenza da amplificare includa uno o piu' siti CpG informativi (Zuccotti et al., 1993). I campioni verranno poi analizzati mediante elettroforesi su gel di agarosio.

"Bisulfite genome sequencing"
Il DNA verra' denaturato in una soluzione contenente: 3M NaOH, 2M sodio metabisulfito, 0,5 mM idrochinone e 2 µg di tRNA di E. coli. Verra' quindi incubato per 4 ore a 50 C. I campioni di DNA verranno desalinizzati utilizzando il sistema "DNA clean-up" (Promega), eluiti in dH2O, desulfonati in 3M NaOH e quindi precipitati in etanolo. I campioni di DNA trattati con il metodo del bisulfito e quelli non trattati (controllo) verranno amplificati con PCR, utilizzando oligonucleotidi appropriati. I prodotti di amplificazione verranno sequenziati.


BIBLIOGRAFIA

Gentile L., Monti M., Sebastiano V., Merico V., Garagna S., Redi C.A., Zuccotti M.: Single-cell quantitative RT-PCR analysis of Cpt-1b and Cpt-2 gene expression in mouse antral oocytes and in preimplantation embryos. Cytogenet Genome Res 105: 215-221, 2004.

Zuccotti M., Grant M., Monk M.: Polymerase chain reaction for the detection of methylation of a specific CpG site in the G6pd gene of mouse embryos. In: Methods in Enzymology Vol. 225: "A guide to techniques in mouse development". Wassarman P. and DePamphilis M.L. (eds.). Academic Press, San Diego, pp. 557-567, 1993.