RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Strutture sopramolecolari. I complessi Dps (DNA-binding proteins from starved cells)-DNA e sorcina-canali del calcio e loro funzione biologica.

Università di riferimento

Università degli Studi di ROMA "La Sapienza" - SCIENZE BIOCHIMICHE - ROMA(RM)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Emilia CHIANCONE

Descrizione

1. Proteine Dps - DNA

Molte sono le evidenze sperimentali che indicano il coinvolgimento della regione N-terminale delle proteine Dps nel legame con il DNA, ma solo di recente il gruppo proponente ha messo in evidenza che i residui di lisina che vi sono contenuti hanno un ruolo specifico non solo nel determinare la modalità di interazione fra le due macromolecole, ma anche nel promuovere l'auto-aggregazione della proteina in assenza di DNA (2). A tale conclusione è giunto paragonando la Dps di E. coli e due mutanti di delezione dell'N-terminale, Dps-delta8 e Dps-delta18, in cui mancano rispettivamente due o tutte e tre le lisine dell'N-terminale stesso. Esperimenti di gel elettroforesi e di microscopia a forza atomica eseguiti in funzione del pH hanno permesso di dimostrare che la capacità di auto-aggregazione della proteina va di pari passo con quella di condensare il DNA plasmidico, cioè di formare complessi Dps-DNA molto grandi che contengono molte molecole di Dps e uno o più plasmidi. Sia l'autoaggregazione che la condensazione del DNA richiedono che almeno una delle lisine dell'N-terminale sia protonata; la Dps-delta8 infatti auto-aggrega e condensa il DNA a pH minori o uguali a 7.3, ma non a pH 7.7, condizione in cui lega il DNA senza riuscire a condensarlo. Il fatto poi che la Dps-delta18 sia in grado di legare il DNA solo a pH 6.3 indica che possono contribuire al legame altri residui sulla superficie della molecola, ionizzati a questi valori di pH come le istidine 112 e 117.
Il progetto di ricerca è basato su questi risultati e su altre osservazioni non ancora pubblicate. Queste ultime mostrano che nella Dps di E. coli espressa durante la fase stazionaria di crescita le lisine dell'N-terminale sono parzialmente metilate, mentre non lo sono nella proteina estratta durante la fase esponenziale. Mostrano inoltre che la metilazione ha un'influenza profonda sulla modalità di interazione con il DNA, in quanto ne favorisce la condensazione in accordo con i risultati appena discussi. La metilazione delle lisine della regione N-terminale sembra quindi costituire un fattore di regolazione nella formazione dei complessi Dps-DNA non individuato in precedenza e di sicuro interesse anche in un'ottica evolutiva. Il progetto si propone di studiare a fondo gli aspetti strutturali della reazione di metilazione. Sarà valutata la modalità di legame del DNA e l'autoaggregazione delle diverse forme di proteina metilata in funzione del pH utilizzando sia gel elettroforesi che microscopia a forza atomica (in collaborazione con C. Rivetti e G. L. Rossi dell'Università di Parma) e ultracentrifugazione analitica. Al fine di comprendere le ricadute funzionali sarà valutata l'entità della reazione di metilazione in funzione di diverse condizioni di crescita del batterio. Sulla base anche delle conoscenze acquisite nello studio delle proteine Dps estratte da altri batteri, si può ipotizzare che lo stress ossidativo non debba avere grande influenza sulla metilazione, poiché questa non altera l'attività ferrossidasica della proteina; verrà saggiato pertanto soprattutto l'effetto di altre condizioni di stress (e.g. shock termico, agenti alchilanti). I dati ottenuti saranno discussi nel contesto delle variazioni strutturali della cromatina che si susseguono durante le fasi di crescita di E. coli, variazioni che sono state attribuite alla formazione di complessi ordinati Dps-DNA di natura diversa (19).
In questo contesto si inserisce lo studio della Dps di Thermosynechococcus elongatus, la prima Dps da batteri termofili. La sequenza N-terminale contiene una solo lisina esposta (Lys 8), e da questo punto di vista somiglia al mutante Dps-delta8 della proteina di E. coli appena discusso. La formazione di complessi con il DNA sarà caratterizzata, utilizzando gli approcci metodologici già descritti, non solo il funzione del pH come per la proteina Dps-delta8, ma anche in funzione della temperatura. Ciò permetterà di valutare l'importanza del fattore entropico nella formazione dei complessi "in vitro" e di stimarne la rilevanza biologica nella condizioni estreme di temperatura che caratterizzano l'habitat del batterio.
Nell'ambito del PRIN 2003 sono iniziati esperimenti di co-cristallizzazione della Dps di E. coli con DNA plasmidico che hanno permesso di ottenere co-cristalli di qualità cristallografica, ma estremamente fragili. Si cercherà quindi innanzitutto di migliorare la stabilità dei co-cristalli Dps wt-DNA per poi estendere lo studio anche ai complessi formati dalla Dps metilata. I risultati permetteranno di definire ad un livello di risoluzione mai raggiunto finora la modalità di interazione fra le due macromolecole e quindi di individuare il modello di interazione corretto fra quelli esistenti in letteratura (1, 19, 20).
Si è accennato che nel dodecamero di Dps le regioni N-terminali delle singole subunità sono situate in prossimità dei canali che permettono l'ingresso del Fe(II) al sito ferrossidasico; non è mai stato valutato il loro effetto sulla cinetica di incorporazione, nonostante questa proprietà possa avere rilevanza biologica. Saranno effettuate misure di mescolamento rapido a flusso interrotto in cui le proteine oggetto di studio saranno mescolate in condizioni anaerobiche con soluzioni di Fe(II). Poiché è noto che il legame del Fe(II) al sito ferrossidasico comporta la diminuzione dell'intensità del segnale di fluorescenza intrinseca dalla proteina sarà seguito tale segnale. Questi risultati, insieme a quelli sulla formazione di complessi con il DNA, forniranno un quadro generale su come i batteri possano integrare fra loro i due meccanismi di protezione, quello fisico e quello chimico, che le Dps esercitano nei confronti del DNA.

2. Sorcina - canali del Ca2+

Il programma di ricerca si propone di caratterizzare l'interazione fra sorcina e singoli canali del Ca2+ nei suoi aspetti molecolari e di comprenderne le ricadute fisiologiche. Oggetto di studio saranno sia la dipendenza dalla concentrazione di Ca2+ dei parametri cinetici e termodinamici della reazione di legame che la topologia dell'interazione; si può immaginare infatti che, durante il ciclo eccitazione-contrazione-decontrazione del muscolo, si stabilisca fra la sorcina e i diversi canali una rete di interazioni che coinvolge questi ultimi in contemporanea e/o in successione e permette alla sorcina di contribuire alla regolazione dei flussi del calcio all'interno della cellula.
Fra i canali del calcio saranno studiati in particolare il recettore della rianodina, RyR, e lo scambiatore Na+-Ca2+, NCX; oltre alla sorcina verranno utilizzati il dominio C-terminale che lega il Ca2+ (SCBD), quello N-terminale, e mutanti sito-specifici sia della mano EF3 a più alta affinità per il calcio (E124A), che dell'elica D poiché come già accennato questa elica svolge un ruolo critico nel trasmettere al resto della molecola l'informazione che il catione si è legato al sito EF3, e.g. i mutanti W99G e W105G, già disponibili, in cui sono stati sostituiti gli unici due residui di triptofano della catena polipeptidica.
Verrà inoltre caratterizzato il mutante F112L, con una mutazione nella regione di raccordo tra l'elica D e l'ansa legante il calcio del sito EF3 che è stata descritta in una forma familiare di cardiomiopatia ipertrofica (21). Il mutante è stato espresso in E. coli e purificato sia come proteina intera che come dominio di legame del calcio; si intende ottenere cristalli di qualità cristallografica, risolvere la struttura tridimensionale della proteina e valutare come la mutazione alteri l'interazione della sorcina con le proteine bersaglio dando luogo al fenotipo patologico.
L'interazione della sorcina con i recettori della rianodina RyR1 ed il RyR2, espressi principalmente nel muscolo scheletrico ed in quello cardiaco, è la più studiata anche dal punto di vista fisiologico. È noto che il rilascio del calcio dal reticolo sarcoplasmatico avviene mediante gruppi (clusters) di unità RyR. L'attività di gruppi isolati di RyR genera eventi localizzati di rilascio del catione, denominati Ca2+-sparks, che si esauriscono nel giro di pochi millisecondi e rappresentano una forma di evento elementare stocastico (22). In cardiomiociti isolati permeabilizzati la sorcina (oltre a proteine come la calmodulina e l'FKBP12) inibisce in modo significativo l'attività del RyR (23), diminuendo la frequenza, l'ampiezza e la durata dei Ca2+-sparks (17, 24, 25); inoltre, la dinamica dell'interazione è tale da permettere alla sorcina di inibire il canale in pochi msec, un tempo compatibile con il battito cardiaco (24).
Il legame della sorcina con il RyR avviene tramite il dominio C-terminale (26), ma la topologia fine dell'interazione non è nota anche se è presumibile sia coinvolta la regione intorno all'elica D, ricca di residui idrofobici. Saranno pertanto effettuate, in collaborazione con il Prof. G. L. Smith dell'Università di Glasgow, misure dei transienti o "sparks" di Ca2+ su cardiomiociti isolati di coniglio, perfusi con la sorcina, il dominio SCBD o i mutanti suddetti. L'esperimento consiste nella misura diretta dei transienti di Ca2+, rivelati con il fluoroforo Fluo-3 che permette di determinarne valore medio del picco, durata, ampiezza e frequenza. L'effetto relativo di sorcina, SCBD e singoli mutanti su questi parametri permetterà di definire la regione specifica del dominio C-terminale coinvolta nell'interazione. I dati potranno anche fornire la conferma del meccanismo di attivazione della sorcina proposto da Mella et al. (13) sulla base di esperimenti "in vitro".
Anche per individuare la regione della sorcina coinvolta nell'interazione con lo scambiatore Na+-Ca2+ saranno utilizzati, insieme ad esperimenti di immunoprecipitazione e di Western blot, cardiomiociti isolati. Quest'ultimo sistema sperimentale infatti ha permesso di dimostrare un aumento dell'attività dell'NCX in seguito alla trasfezione con sorcina (17). Lo scambiatore, situato nel sarcolemma cardiaco, è elettrogenico, poiché coinvolge il movimento di 3 ioni Na+ per ciascun ione Ca2+, e può agire nelle due direzioni, a seconda della concentrazione degli ioni coinvolti e del potenziale di membrana (27). Durante fasi differenti del ciclo eccitazione-contrazione, l'NCX è in grado di generare sia correnti depolarizzanti che ripolarizzanti, anche se la funzione fisiologicamente più importante consiste nell'estrusione di calcio dal citoplasma in seguito al rilascio dello ione da parte del reticolo sarcoplasmatico (28). In cardiomiociti di coniglio isolati, sempre in collaborazione con il Prof. G. L. Smith, sarà misurata la corrente di membrana in risposta ad una rampa di 3 secondi del potenziale di membrana da –120 a 80 mV in presenza di Ca2+, ATP e creatina (17, 29). Le misure saranno effettuate sia in assenza che in presenza di 5 mM NiCl2, condizione in cui l'NCX è inibito completamente, e verrà saggiato l'effetto di sorcina, SCBD e singoli mutanti. L'insieme dei risultati ottenuti permetterà di definire con una certa precisione la regione della sorcina coinvolta nell'interazione con NCX.
L'identificazione delle regioni di RyR e NCX che interagiscono con la sorcina è più complessa a causa delle dimensioni delle regioni citoplasmatiche di queste proteine integrali di membrana. Pertanto sarà messa in atto una strategia sperimentale diversa, basata sulla tecnica detta del "phage display" (30). In breve, la sorcina immobilizzata su supporti diversi (piastre di polistirene o una matrice di Sefarosio) sarà utilizzata per selezionare, a partire da librerie di fagi filamentosi della famiglia fd-tet che espongono peptidi fusi a regioni della proteina di rivestimento pIII del fago, quei peptidi che interagiscono con alta affinità ed in maniera calcio-dipendente con la sorcina. Due tipi di librerie di phage display verranno usate: una di peptidi casuali di 15 aminoacidi, ottenuta a partire da oligonucleotidi sintetizzati in modo degenerato, ed una di peptidi di 30-400 residui corrispondenti a frammenti casuali delle proteine bersaglio. I frammenti casuali saranno ottenuti per espressione di peptidi derivanti dalla frammentazione parziale con DNasi I del cDNA di RyR1, RyR2, NCX ed anche di RyR3. RyR3 verrà studiato perché ha un'omologia di sequenza molto elevata con RyR1 e RyR2 ed è presumibile quindi che sia in grado di interagire con la sorcina; è espresso a livelli elevati nel corpo striato, nel talamo e nell'ippocampo ed è importante nell'apprendimento e nella plasticità sinaptica.
Individuati i peptidi di RyR e NCX che costituiscono i siti di interazione con la sorcina, verranno determinati i parametri cinetici e termodinamici della reazione di legame mediante risonanza di plasma di superficie (SPR). La SPR, che utilizza biosensori ottici, è una delle metodiche di elezione per l'analisi dell'interazione tra macromolecole. Il sensore è disegnato in modo che un ligando fluisca su molecole immobilizzate su un supporto inerte di destrano, adeso ad un sottile strato d'oro, e possa interagire con queste. L'interazione fa variare in tempo reale l'indice di rifrazione del mezzo e, di conseguenza, l'angolo a cui la luce incidente sull'altra faccia della lamina metallica è assorbita per il fenomeno ottico di SPR. La metodica consente di effettuare un'analisi dell'interazione ligando-molecola immobilizzata dalla quale è possibile determinare non solo le costanti cinetiche di associazione e dissociazione ma anche la costante di equilibrio. In pratica, saranno immobilizzati su biosensori del tipo CM5, adatti a questo scopo, i peptidi di RyR e NCX precedentemente selezionati, su questi saranno fatte fluire soluzioni di sorcina a diverse concentrazioni di proteina e di calcio e saranno misurate le fasi di associazione e dissociazione dell'interazione.
Il paragone dei parametri cinetici e di affinità ottenuti fornirà un quadro delle caratteristiche strutturali che determinano specificità ed affinità nelle interazioni tra sorcina ed i diversi canali del Ca2+. A sua volta tale quadro riflette la rete di interazioni che si stabilisce nella cellula cardiaca a seguito della traslocazione della sorcina alle membrane e, pertanto, darà un contributo significativo alla conoscenza della funzione di regolazione della sorcina stessa.