Contenuto
Ti trovi in: HOME »Programmi, progetti e risultati »I progetti »PRIN - Programmi di ricerca di Rilevante Interesse Nazionale»Programma di ricerca»Unità di ricercaINIZIO_TESTO_DA_INDICIZZARE
UNITA' DI RICERCA
italiano - english
Bibliografia
Bannon, J. et al., Behavioral characterization of neuropeptide Y knockout mice, Brain Res. 868: 79–87, 2000Barbaccia ML. et al. The effects of inhibitors of GABAergic transmission and stress on brain and plasma allopregnanolone concentrations. Br J Pharmacol. 120:1582-8, 1997
Broqua, JG.et al.Behavioral effects of neuropeptide Y receptor agonists in the elevated plus-maze and fear-potentiated startle procedures, Behav. Pharmacol. 6: 215–222, 1995
Cagetti, E. et al. Withdrawal from chronic intermittent ethanol treatment changes subunit composition, reduces synaptic function, and decreases behavioral responses to positive allosteric modulators of GABAA receptors. Mol Pharmacol 63:53–64, 2003
Concas, MC. et al. Role of brain allopregnanolone in the plasticity of gamma-aminobutyric acid type A receptor in rat brain during pregnancy and after delivery. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13284–13289, 1998
Devaud, LL. et al.Bidirectional alterations of GABAA receptor subunit peptide levels in rat cortex during chronic ethanol consumption and withdrawal. J Neurochem 69: 126–130,1997
Ebert, B. et al. Differences in agonist/antagonist binding affinity and receptor transduction using recombinant human γ-aminobutyric acid type A receptors, Mol Pharmacol 52: 1150–1156,1997
Ehlers, CL. et al. Long latency event-related potentials in rats: response of amygdala, nucleus accumbens, dorsal hippocampus and frontal cortex to changes in reward characteristics of conditioned stimuli.Brain Res.780:138-42, 1998
Ferrara, G. et al. Increased expression of the neuropeptide Y receptor Y(1) gene in the medial amygdala of transgenic mice induced by long-term treatment with progesterone or allopregnanolone J Neurochem. 79:417-25, 2001
Follesa, P. et al. Allopregnanolone synthesis in cerebellar granule cells: roles in regulation of GABAA receptor expression andfunction during progesterone treatment and withdrawal. Mol. Pharmacol. 57:1262–1270, 2000
Gustafson EL. et al. Neuropeptide Y localization in the rat amygdaloid complex. J Comp Neurol.251:349-62,1986
Heilig, MB. et al. Centrally administered neuropeptide Y (NPY) produces anxiolytic-like effects in animal anxiety models, Psychopharmacology 98: 524–529, 1989
Heilig, M. et al. Anxiolytic-like effect of neuropeptide Y (NPY), but not other peptides in an operant conflict test, Regul. Pept. 41: 61–69, 1992
Heilig M Antisense inhibition of neuropeptide Y (NPY)-Y1 receptor expression blocks the anxiolytic-like action of NPY in amygdala and paradoxically increases feeding. Regul Pept. 59:201-5, 1995
Heilig, MO. et al. Decreased cerebrospinal fluid neuropeptide Y (NPY) in patients with treatment refractory unipolar major depression: preliminary evidence for association with preproNPY gene polymorphism, J. Psychiatr. Res. 38:113–121, 2004
Hendry, SH. et al.Neuropeptide-containing neurons of the cerebral cortex are also GABAergic. Proc Natl Acad Sci U S A.81:6526-30,1984
Lambert, JJ. et al.Modulation of native and recombinant GABAA receptors by endogenous and synthetic neuroactive steroids. Brain Res Rev 37, pp. 68–80, 2001
Kask, A. et al.Alpha-helical CRF(9-41) prevents anxiogenic-like effect of NPY Y1 receptor antagonist BIBP3226 in rats. Neuroreport. 8:3645-7, 1997
Khisti, RT. et al.Neuroactive steroid 3 alpha-hydroxy-5 alpha-pregnan-20-one modulates ethanol-induced loss of righting reflex in rats. Brain Res.980:255-65, 2003
McDonald, AJ. et al Coexistence of GABA and peptide immunoreactivity in non-pyramidal neurons of the basolateral amygdala. Neurosci Lett. 100:53-8, 1989
Mahmoudi, M. et al.Chronic intermittent ethanol treatment in rats increases GABAA receptor alpha4-subunit expression: possible relevance to alcohol dependence. J Neurochem 68: 2485–2492, 1997
Mhatre, MC. and Ticku, MK. Chronic ethanol administration alters gamma-aminobutyric acid A receptor gene expression. Mol Pharmacol 42: 415–422, 1992
Mele, P. et al.Increased expression of the gene for the Y1 receptor of neuropeptide Y in the amygdala and paraventricular nucleus of Y1R/LacZ transgenic mice in response to restraint stress. J Neurochem 89:1471-8, 2004
Moran, MH. et al.Progesterone withdrawal: II. Insensitivity to the sedative effects of a benzodiazepine. Brain Res 807: 91–100, 1998
Oberto, A. et al. GABAergic and NPY-Y(1) network in the medial amygdala: a neuroanatomical basis for their functional interaction Neuropharmacol.41:639-42, 2001
Oberto, A. et al.Changes in expression of the neuropeptide Y Y1 receptor gene in the medial amygdala of transgenic mice during pregnancy and after delivery.J Neurochem. 82:1272-81, 2002
Oin, Y. et al.Chronic unpredictable stress alters gene expression in rat single dentate granule cells.J Neurochem. 2004 89:364-74, 2004
Rasmusson et al.Low baseline and yohimbine-stimulated plasma neuropeptide Y (NPY) levels in combat-related PTSD, Biol. Psychiatry 47: 526–539, 2000
Redrobe, JPY. et al.The neuropeptide Y (NPY) Y1 receptor subtype mediates NPY-induced antidepressant-like activity in the mouse forced swimming test, Neuropsychopharmacol. 26: 615–624, 2000
Papadeas, S. et al. Chronic ethanol consumption differentially alters GABAA receptor alpha1 and alpha4 subunit peptide expressions and GABAA receptor-mediated 36Cl uptake in mesocorticolimbic regions of rat brain. Alcohol Clin Exp Res 25: 556-558,2001
Sanna, E. et al.Brain steroidogenesis mediates ethanol modulation of GABAA receptor activity in rat hippocampus. J Neurosci.24:6521-30, 2004
Smith, SS. et al. Withdrawal from 3alpha-OH-5alpha-pregnan-20-one using a pseudopregnancy model alters the kinetics of hippocampal GABAA-gated current and increases the GABAA receptor alpha4 subunit in association with increased anxiety. J. Neurosci. 18: 5275–5284, 1998
Serra, M. et al. Social isolation-induced decreases in both the abundance of neuroactive steroids and GABA(A) receptor function in rat brain. J Neurochem. 75:732-40, 2000
Serra, M. et al. Social isolation-induced increase in the sensitivity of rats to the steroidogenic effect of ethanol. J Neurochem. 85:257-63, 2003
Sorensen, G. et al. Differential roles for neuropeptide Y Y1 and Y5 receptors in anxiety and sedation. Neurosci Res. 77:723-9, 2004
Thorsell, A. et al. Behavioral insensitivity to restraint stress, absent fear suppression of behavior and impaired spatial learning in transgenic rats with hippocampal neuropeptide Y overexpression, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97:12852–12857, 2000
Tovote, M. et al. Central NPY receptor-mediated alteration of heart rate dynamics in mice during expression of fear conditioned to an auditory cue, Regul. Pept. 120: 205–214, 2004
Wahlestedt, C. et al. Modulation of anxiety and neuropeptide Y-Y1 receptors by antisense oligodeoxynucleotides. Science259:528-31, 1993
Whiting PJ, Wafford KA, and McKernan RM (2000) Pharmacologic subtypes of GABAA receptors based on subunit composition, in GABA in the Nervous System: The View at Fifty Years (Martin DL and Olsen RW eds) pp 113-126, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia.
Wafford KA, Functional characterization of human gamma-aminobutyric acidA receptors containing the alpha 4 subunit.Mol Pharmacol. 50:670-8, 1996
Programma di ricerca
Effetto della delezione condizionale del recettore Y1 per l'NPY nell'interazione funzionale tra recettore GABAA e l'NPY in condizioni di stress ed esposizione cronica all'etanoloUniversità di riferimento
Università degli Studi di CAGLIARI - BIOLOGIA SPERIMENTALE - CAGLIARI(CA)Responsabile dell'Unità di ricerca
Giovanni BIGGIODescrizione
I dettagli tecnici sullo sviluppo e sulle caratteristiche genetiche dei topi knock-out condizionali e regione-specifici per il Y1R sono descritti nel modello B dell'Unità di ricerca di Torino.FASE I
Nei topi Y1Rfb-/-;Y1RVenus (knockout )e DoxY1Rlox/lox;Y1RVenus (controlli)in questa fase verrà analizzato l'effetto dell'inattivazione condizionale del gene del Y1R nel proencefalo sui livelli di neurosteroidi, sull'espressione di alcune subunità del recettore GABAA, e sulla sua funzione, in condizioni basali e dopo somministrazione acuta di etanolo
a. Misurazione dei livelli cerebrali di neurosteroidi
Gli steroidi verranno estratti dalla corteccia cerebrale con acetato di etile e purificati su cartucce Seppak-silice. Gli steroidi verranno ulteriormente purificati e separati mediante cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC) su colonne Lichrosorb-diol sviluppate con un gradiente discontinuo di 2-propanolo in esano. La misurazione dei singoli steroidi verrà effettuata mediante dosaggio radioimmunologico, con anticorpi specifici, sul contenuto delle corrispondenti frazioni dell'HPLC come precedentemente descritto (Serra, M., et al. J Neurochem, 2000. 7: 732-40).
b. Studio dell'espressione genica delle diverse subunità del recettore GABAA.
Allo scopo di valutare eventuali modificazione della struttura del recettore GABAA in seguito alla delezione del Y1R nell'amigdala e nell'ippocampo, verrà valutata l'espressione genica delle subunità alfa 1,alfa 2,alfa 4,gamma2 e delta quella di alfa4 e delta nell'ippocampo mediante immunoistochimica utilizzando anticorpi policlonali diretti contro le varie subunità dei recettori GABAA (Pirker et al., Neurosi. 101:815, 2000). Gli animali verranno anestetizzati con una dose letale di anestetico e perfusi con tampone e formaldeide. I cervelli postfissati nella stessa soluzione, verranno tagliati al vibratomo in sezioni sagittale e coronale. L'immunoistiochimica verrà eseguita su fettine flottanti. In breve, dopo trattamento con perossido di idrogeno in metanolo e siero d'asino al 10%, le fettine verranno incubate per tutta la notte a 4 °C con l'anticorpo primario specifico per la subunità in esame. Dopo lavaggio dell'anticorpo primario, le fettine saranno incubate con l'anticorpo secondario per le immunoglobuline G di capra coniugato con la biotina. Dopo lavaggi, il legame con gli anticorpi verrà evidenziato incubando le fettine con streptavidina coniugata alle perossidasi, la rivelazione dell'immunocomplesso verrà fatta incubando le sezioni con 3'3-diaminobenzidina e perossido di idrogeno. Le fettine verranno osservate al microscopio in campo chiaro e i livelli delle subunità verranno quantificate mediante l'utilizzo di un programma per l'analisi d'immagine.
c. Misurazione delle proprietà funzionali e farmacologiche dei recettori GABAA.
L'analisi funzionale verrà effettuata su neuroni in fettine (circa 300um) di ippocampo e di amigdala dei topi Y1Rfb-/-;Y1RVenus (knockout )e DoxY1Rlox/lox;Y1RVenus (controlli)con la tecnica del patch-clamp in configurazione whole-cell. Verranno misurate le correnti postsinaptiche inibitorie (IPSC) spontanee o stimolate elettricamente e gli effetti dell'etanolo e dei neurosteroidi sulle IPSC. Il potenziale di membrana dei neuroni verrà mantenuta a –60 mV e le IPSC verranno isolate farmacologicamente in presenza di antagonisti dei recettori glutamatergici.
FASE II
In questa fase verrà analizzato l'effetto dell'isolamento sociale nel proencefalo dei topi knock-out condizionali per il recettore Y1 sui livelli di neurosteroidi, sull'espressione di alcune subunità del recettore GABAA, e sulla sua funzione in condizioni basali e dopo somministrazione acuta di etanolo.
L'isolamento sociale, in maniera opposta allo stress acuto, induce una diminuzione prolungata di diverse settimane nelle concentrazioni cerebrali di neurosteroidi (Serra et al., J Neurochem. 75:732-40, 2000), e un aumento dell'effetto steroidogenico dell'etanolo (Serra et al., J Neurochem. 85:257-63, 2003). Inoltre, la perfusione di etanolo in fettine ippocampali preparate dal cervello di ratti isolati determina un aumento delle correnti postsinaptiche inibitorie GABA-dipendenti registrate sui neuroni della CA1 significativamente più elevato di quello indotto su fettine di ratti di controllo (Serra et al., in preparazione).
Trattamento degli animali
Saranno utilizzati quattro gruppi di animali immediatamente dopo lo svezzamento.Gli animali del primo gruppo, costituito da topi Y1Rfb-/-;Y1RVenus (knockout)saranno stabulati singolarmente (isolati) per 30 giorni; Gli animali del secondo, costituito da topi Y1Rfb-/-;Y1RVenus (knockout)saranno stabulati 6 per gabbia; gli animali del terzo gruppo (isolati) e del quarto gruppo (stabulati in gruppo) saranno costituiti da topi DoxY1Rlox/lox;Y1RVenus (controlli). Dopo 30 giorni ciascun gruppo sarà ulteriormente suddiviso in due gruppi che saranno trattati con etanolo (1 g/Kg i.p.) o acqua, rispettivamente.
a. Misurazione dei livelli cerebrali di neurosteroidi. L'estrazione purificazione e quantificazione degli steroidi verranno effettuate come già descritto nella fase I.
b. Studio dell'espressione genica delle diverse del recettore GABAA. L'espressione genica delle subunità alfa 1,alfa 2, alfa 4,gamma2 e delta quella di alfa4 e delta nell'ippocampo mediante immunoistochimica verrà effettuata come già descritto nella fase I.
c. Misurazione delle proprietà funzionali e farmacologiche dei recettori GABAA. L'analisi funzionale verrà effettuata come già descritto nella fase I.
FASE III
In questa fase verrà analizzato l'effetto del consumo volontario di etanolo duramte l'isolamento sociale nel proencefalo dei topi knock-out condizionali per il Y1R sui livelli di neurosteroidi, sull'espressione di alcune subunità del recettore GABAA, e sulla sua funzione.
Trattamento degli animali
Saranno utilizzati quattro gruppi di animali immediatamente dopo lo svezzamento. Il primo sarà costituito da topi Y1Rfb-/-;Y1RVenus (knockout) il secondo da topi DoxY1Rlox/lox;Y1RVenus (controlli), entrambi i gruppi saranno stabulati singolarmente e verrà data loro libera scelta tra acqua e una soluzione di etanolo in acqua, progressivamente crescente da 3 a 10%. Il consumo relativo di etanolo verrà valutato. Il terzo gruppo e quarto gruppo di animali sarà costituito da topi Y1Rfb-/-;Y1RVenus (knockout ) e da topi DoxY1Rlox/lox;Y1RVenus (controlli), rispettivamente, che avranno accesso solo all'acqua. Alla fine del trattamento, ciascun gruppo sarà ulteriormente suddiviso in due gruppi che saranno trattati con etanolo (1 g/Kg i.p.) o acqua, rispettivamente.
a. Misurazione dei livelli cerebrali di neurosteroidi. L'estrazione purificazione e quantificazione degli steroidi verranno effettuate come già descritto nella fase I.
b. Studio dell'espressione genica delle diverse del recettore GABAA. L'espressione genica delle subunità alfa 1,alfa 2, alfa 4,gamma2 e delta quella di alfa4 e delta nell'ippocampo mediante immunoistochimica verrà effettuata come già descritto nella fase I.
c. Misurazione delle proprietà funzionali e farmacologiche dei recettori GABAA. L'analisi funzionale verrà effettuata come già descritto nella fase I.
