RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Caratterizzazione di enzimi dotati di attività N-glicosilasica [proteine inattivanti i ribosomi (RIP)] come tools per applicazioni in campo bio-medico ed agrario.

Università di riferimento

Università degli Studi de L'AQUILA - BIOLOGIA DI BASE ED APPLICATA - L'AQUILA(AQ)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Rodolfo IPPOLITI

Descrizione

Programma di ricerca Unità Operativa L'Aquila

Il programma di ricerca sarà articolato in tre settori di intervento:

1) Riconoscimento del substrato ed attività enzimatica di RIPs
2) Produzione di RIPs ricombinanti e mutagenesi sito-specifica
3) Studio dell'interazione con cellule eucariotiche e meccanismi di assorbimento cellulare di RIPs da pianta e ricombinanti


1: Riconoscimento del substrato ed attività enzimatica di RIPs

1a Il riconoscimento molecolare dei substrati delle RIPs sarà studiato attraverso l'uso di tecniche spettroscopiche utilizzando oligonucleotidi sintetici in grado di mimare la struttura del sito bersaglio delle tossine (l'rRNA 28S). Nella struttura del loop contenente la sequenza bersaglio GAGA verranno inseriti derivati delle basi (es. 2-aminopurina) in grado di avere cambiamenti sensibili di fluorescenza in funzione delle modificazioni dell'intorno proteico e della conformazione dell'oligonucleotide. Il rilascio dell'adenina bersaglio dovrebbe produrre significativi cambiamenti di orientamento dei residui nucleotidici e dare essa stessa un segnale registrabile in seguito alla perdita delle interazioni di stacking che coinvolgono residui di tirosina nel sito catalitico della tossina. Queste variazioni verranno seguite in maniera da registrare delle cinetiche enzimatiche, e variando le concentrazioni dei substrati sarà possibile costruire delle curve di Michaelis-Menten per ottenere dati sulla reattività a stato stazionario di queste tossine. Saranno inoltre utilizzati oligonucleotidi complementari di DNA, per creare dei substrati a doppio filamento e studiare l'attività enzimatica delle RIPs sul DNA.
RIPs da pianta e ricombinanti (vedi 2) saranno immobilizzate su supporti solidi (chip) per studiare l'interazione tra la tossina ed i suoi substrati (ribosomi, oligo) utilizzando la tecnica della risonanza plasmonica (i.e. Biacore, in collaborazione con l'Università di Roma La Sapienza e l'Università di Siena). Questa tecnica permetterà di paragonare le varie tossine utilizzando substrati diversi. Verranno inoltre cercate le condizioni sperimentali per ottenere l'immobilizzazione di ribosomi su tali supporti, in maniera da ottenere un chip universale con il quale testare le diverse RIPs. L'uso di tossine ricombinanti potrà in tal senso essere utile per introdurre dei gruppi extra da utilizzare per la derivatizzazione chimica delle tossine in modo da ottenere una distribuzione omogenea della proteina sulla superficie del chip.
1b Saranno utilizzati inoltre substrati naturali e sintetici ( quali plasmidi, ribosomi procariotici e/o eucariotici, oligonucleotidi sintetici) per studiare l'interazione delle RIPs attraverso l'uso di tecniche di microscopia a forza atomica , utilizzando il microscopio sia nella configurazione Tapping Mode Microscopy che in quella per Spettroscopia di Forze.
Nel primo caso (il cantilever viene posto in oscillazione alla sua frequenza di risonanza e posizionato sulla superficie in modo che la punta la tocchi solo per una piccola frazione della sua oscillazione) sarà possibile osservare con un limite risolutivo confrontabile con quello della Microscopia Elettronica campioni nel loro "stato fisiologico" perché, come noto, le osservazioni con AFM non richiedono particolari preparazioni dei campioni quali ad esempio metallizzazione, inclusione, sezionamento o altro.
Nel caso invece della Spettroscopia di Forza verrà effettuato un approfondito studio dell'interazione locale tra sonda e campioni, attraverso la registrazione delle curve di forza; avvicinando ed allontanando in modo controllato sonda e campione e rilevando contemporaneamente la deflessione della leva, si potrà misurare accuratamente la forza di attrazione o repulsione che li interessano.
1c Modificazioni conformazionali del substrato ribosomale verranno analizzate attraverso l'analisi dell'intensità di fluorescenza dovuta al legame con etidio bromuro; verrà valutata la costante di associazione EtBr - ribosoma, la sua variazione nelle diverse condizioni di saggio e il numero di siti di interazione; verranno utilizzate preparazioni di ribosomi di derivazione sia procariotica che eucariotica e RIP di tipo 1, in particolare isoforme naturali di saporina e/o suoi derivati mutagenizzati

2: Produzione di RIPs ricombinanti e mutagenesi sito-specifica
2a Verranno utilizzati cloni già esistenti o di nuova selezione per creare mutanti sito-specifici o mutanti per delezione di alcune RIPs (in particolare di isoforme della saporina). Si studierà l'effetto dell'introduzione di mutazione in regioni putative di interazione con i substrati macromolecolari (ribosomi) ed i substrati sintetici (oligonucleotidi). In particolare verranno esplorate le zone dei residui che circondano il sito catalitico e le zone dell'amminico terminale e del carbossilico terminale. Verranno introdotte mutazioni su residui carichi (in particolare lisine) trasformando il(i) residuo(i) in corrispondenti residui di carica opposta o residui non polari. Il presupposto è che il riconoscimento molecolare dei substrati avvenga utilizzando interazioni elettrostatiche in prima battuta ed interazioni di diverso tipo per il raffinamento dell'interazione.
Sono al momento già disponibili alcuni mutanti che saranno utilizzati per iniziare gli studi, ed in particolare mutanti delle lisine 220, 226 e 234 (mutati in alanina) costruiti nel gene della saporina e mutanti di delezione della porzione C-terminale della stessa proteina. Queste proteine sono state in parte caratterizzate per la loro attività sui ribosomi di lievito e dimostrano una interessante alterazione della loro capacità i riconoscere i substrati.
2b L'espressione eterologa e tessuto-specifica di saporina wild type e/o mutanti in piante transgeniche sarà seguita valutando il tipo di danno cellulare indotto, con particolare riguardo ai fenomeni apoptotici.


3: Studio dell'interazione con cellule eucariotiche e meccanismi di assorbimento cellulare di RIPs da pianta e ricombinanti

3a Le interazioni con le membrane cellulari delle cellule eucariotiche ed i successivi passaggi all'interno della cellula, saranno studiati utilizzando RIPs monomeriche (es. saporina) e coniugate con anticorpi o vettori di natura proteica. Lo scopo di questa parte sperimentale è quello di identificare eventuali "partners" proteici cellulari coinvolti nel trasporto delle tossine fino al citoplasma. Per evidenziare ed analizzare queste proteine sarà necessario congelare le eventuali interazioni che la tossina potrà avere durante il suo processo di assorbimento, utilizzando la tecnica del cross-linking chimico. Verranno pertanto utilizzati composti bi-funzionali in grado di reagire da un lato con la tossina e dall'altro con un'eventuale proteina cellulare che si trovi a distanza sufficientemente breve dalla molecola RIP. In particolare verranno utilizzati composti foto-attivabili attraverso l'esposizione a luce UV. Le cellule verranno quindi incubate al buio in presenza della RIP modificata e successivamente al legame sulla membrana, a tempi diversi verrà indotta l'attivazione dell'agente di cross-linking. Il prodotto di questa reazione verrà identificato ed eventualmente isolato attraverso tecniche immuno-chimiche, utilizzando anticorpi contro la RIP (alcuni già esistenti). Successivamente si procederà ad un'analisi ed identificazione della proteina cross-linkata attraverso spettrometria di massa e microsequenziamento. L'identificazione di eventuali proteine a tempi diversi permetterà quindi di tracciare il percorso endocitotico della tossina.
Verranno inoltre prodotti derivati fluorescenti di alcune tossine da utilizzare per studi co-localizzazione mediante l'uso di anticorpi specifici per marcatori di compartimenti cellulari ed in particolare si potranno fare in collaborazione con il Dr. Jeremy Simpson (EMBL, Heidelberg) esperimenti di co-localizzazione con linee cellulari esprimenti proteine fuse alla GFP localizzate in particolari distretti cellulari. Questi esperimenti rappresenteranno un innovazione essendo un sistema non invasivo per le cellule e permetteranno di studiare i processi anche "in vivo" su colture cellulari con tecniche di microscopia in fluorescenza confocale.
Verranno infine testati alcuni composti in grado di aumentare l'efficienza citotossica delle RIPs, allo scopo di valutarne l'influenza sui percorsi cellulari di RIPs ed immunotossine, e proporne l'eventuale utilizzo in protocolli terapeutici. In questo tipo di applicazione abbiamo ottenuto dati preliminari utilizzando sostanza farmacologicamente attive ed approvate in terapia come la clorochina e l'AZT.
3b Il punto precedente (2b) è propedeutico all'uso delle tossine per ottenere l'ablazione genetica di specifici tessuti coinvolti nella maturazione del polline, con l'obiettivo di controllare il rilascio di allergeni nell'ambiente. L'ottenimento di piante transgeniche che esprimono RIP sotto il controllo di promotori costitutivi è reso problematico dalla elevata tossicità di questi enzimi; tutte le piante sino ad oggi ingegnerizzate presentano costrutti sotto controllo di promotori inducibili ovvero promotori costitutivi accoppiati a RIP di bassa tossicità. Si allestiranno vettori di espressione in cui RIP di diversa tossicità (in particolare diverse isoforme naturali di saporina e/o suoi derivati mutagenizzati ) saranno poste sotto controllo di promotori tessuto specifici da utilizzare in esperimenti di trasformazione transiente o permanente, allo scopo di valutarne l'espressione in vivo, con particolare riferimento alla loro localizzazione subcellulare e all'induzione di processi apoptotici.
Un interessante tessuto candidato a questo scopo è il ‘tappeto', presente negli organi sporofitici sia di mono che dicotiledoni dove svolge un ruolo cruciale nello sviluppo del polline. Sono disponibili sequenze regolative specifiche per questo distretto tissutale, che potranno essere utilizzate nella ingegnerizzazione di specie modello (Nicotiana) allo scopo di indurre l'aborto prematuro delle microspore. L'approccio potrà essere successivamente applicato a specie il cui polline contribuisca in modo significativo allo sviluppo di patologie allergiche.