RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Metodi non invasivi per lo studio delle basi biologiche e fisiopatologiche delle malattie respiratorie: applicazioni cliniche ed epidemiologiche.

Università di riferimento

Università degli Studi di PARMA - CLINICA MEDICA, NEFROLOGIA E SCIENZE DELLA PREVENZIONE - PARMA(PR)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Antonio MUTTI

Descrizione

Scopo del presente progetto di ricerca è la validazione del CAE come matrice biologica per l'identificazione di indicatori di dose e di risposta polmonare in lavoratori professionalmente esposti ad elementi metallici pneumotossici.

La valutazione dell'esposizione professionale a metalli può avvalersi di diversi strumenti e strategie, anche tra loro combinate, tra cui il dosaggio del metallo stesso in diverse matrici biologiche, come sangue e urina, che consentono di stimare la dose assorbita o l'accumulo nei tessuti o, in alcuni casi, la dose al bersaglio pervenuta all'organo critico attraverso la circolazione sistemica. Finora, è sempre stato problematico valutare la dose al bersaglio quando l'organo critico è rappresentato dalla stessa porta d'ingresso, come nel caso delle vie aeree. In particolare, la dose assorbita non riflette necessariamente quella attiva a livello polmonare. Anzi, al contrario, è verosimile che gli effetti polmonari debbano essere attribuiti alla frazione ritenuta a livello delle vie respiratorie, piuttosto che a quella assorbita e passata nella circolazione sistemica.
Con l'applicazione di un metodo di prelievo, ma soprattutto di un concetto innovativo, abbiamo recentemente dimostrato che il condensato dell'aria espirata (CAE) consente di identificare indicatori utili per definire in modo più appropriato l'esposizione e gli effetti tossici conseguenti all'esposizione ad elementi metallici tossici e ad altri inquinanti ambientali introdotti per via inalatoria.

L'analisi di elementi in tracce, quali metalli, presenti nel CAE, può essere utilizzata per stimare indirettamente la concentrazione di elementi pneumotossici a livello dell'organo bersaglio e potrebbe offrire la possibilità di valutare effetti locali derivanti dalla presenza di sostanze altamente reattive o poco solubili presenti a livello polmonare. La nostra attenzione sarà concentrata principalmente sull'esposizione ad elementi metallici in grado di causare broncopneumopatie o tumori polmonari professionali, quali il Cr, Co e W.

In soggetti professionalmente esposti a Cr(VI), l'apparato respiratorio rappresenta la più importante via di esposizione. L'azione tossica del Cr(VI) a livello polmonare è legata alle sue proprietà ossidanti ed irritanti-corrosive, ma anche all'azione sensibilizzante ed agli effetti citolesivi dei composti del metallo, soprattutto dopo riduzione dallo stato VI a quello III, che mostra notevole affinità per le proteine e si comporta da aptene.
Attualmente, soprattutto grazie all'azione svolta dal medico competente nell'ambito della sorveglianza sanitaria e dell'igiene industriale nei luoghi di lavoro, non si osservano quasi mai marcati danni clinici a carico delle mucose respiratorie, quali ipertrofia, ulcere atrofiche e perforazione del setto nasale, mentre sono aumentate le segnalazioni d'effetti cronici polmonari con conseguenti sviluppo di bronchiti croniche ed enfisema polmonare. Inoltre, le valutazioni della IARC (Agenzia Internazionale per la Ricerca sul Cancro) hanno concluso che esiste sufficiente evidenza per concludere che diversi composti del Cr(VI) sono cancerogeni per l'uomo. E' quindi necessaria un'attenta valutazione degli effetti a livello polmonare provocati dall'esposizione professionale a Cr(VI).

I principali attuali settori industriali nei quali vengono impiegati composti a base di Cr(VI) comprendono: (i) industria metallurgica, particolarmente per la produzione e l'utilizzazione di leghe ferro-cromo (acciai inossidabili o altri acciai speciali con alto contenuto di Cr); (ii) produzione ed impiego di cementi e materiali refrattari; (iii) produzione di alcuni pigmenti costituiti da cromati ed acido cromico; (iv) industria di cromatura galvanica.

Lo studio degli effetti polmonari provocati dall'esposizione a metalli pneumotossici sarà eseguito in un gruppo di lavoratori professionalmente esposti a Cr nell'industria di cromatura galvanica.

L'analisi del CAE potrebbe essere un'interessante metodica per lo studio di questi lavoratori esposti, in grado, infatti, di ottenere informazioni sia sui livelli di Cr presenti a livello polmonare, sia sul riscontro d'indicatori d'effetto cromo correlati. A livello del CAE sono, infatti, quantificabili indicatori di stress ossidativo (acqua ossigenata, aldeidi), la cui determinazione potrebbe permettere sia di rapportare la dose all'effetto polmonare, ma anche di costruire delle vere e proprie curve di dose e risposta, in grado quindi di stabilire, come per i livelli di Cr urinario, livelli di Cr polmonari sovra i quali compaiono effetti tossici. Infatti, pur non essendo completamente noti i meccanismi attraverso i quali l'esposizione a Cr causa un danno polmonare, esistono evidenze scientifiche sia su dati in vivo che in vitro che dimostrano l'importanza dello stress ossidativo nel mediare il danno polmonare da Cr. Nel CAE saranno quindi determinati sia indicatori che riflettono l'aumentata formazione di radicali ossidanti (quali l'acqua ossigenata), che indicatori che si formano in seguito al danno ossidativo provocato da radicali ossidanti sulle molecole cellulari (sarà determinata la malondialdeide come indicatore di ossidazione lipidica)

Nell'ipotesi che l'esposizione professionale a Cr induca alterazioni di indicatori di effetto rilevabili anche a livello sistemico, indagini saranno eseguite su sangue periferico ed urine. In particolare, su queste matrici biologiche saranno dosati indicatori di stress ossidativo a carico di proteine (tramite il dosaggio di gruppi carbonilici proteici su siero) ed a carico del DNA (tramite la determinazione della 8-idrossi-2'-desossiguanosina urinaria). Per la corretta interpretazione dei dati verranno presi in considerazione i fattori individuali di suscettibilità geneticamente determinati, con particolare riferimento ai polimorfismi degli enzimi della biotrasformazione pertinenti per il cromo e della riparazione del danno ossidativo.

Per una più precisa comprensione della dinamicità delle interazioni tra cromo inalato e risposta polmonare, sarà eseguita anche la speciazione del Cr a livello del CAE. Infatti, mentre a livello urinario si ritiene che tutto il Cr riscontrato sia in stato trivalente (essendo, infatti, questo stato ridotto durante i processi d'assorbimento ed escrezione), la speciazione del Cr a livello del CAE non è nota. E' possibile che il Cr nel CAE abbia un differente comportamento da quello che si osserva nell'urina; questo potrebbe dipendere anche dalla diversa composizione interindividuale del fluido di rivestimento bronco polmonare, la cui differente quantità di sostanze riducenti (glutatione ed acido ascorbico) potrebbe modificare lo stato d'ossidazione del Cr. La contemporanea possibilità di dosare tali sostanze riducenti nel CAE, ancora, potrebbe aiutare a comprendere la diversa suscettibilità individuale all'esposizione della stessa dose di tossici inalanti.

Sulla base dei promettenti studi effettuati in questo campo per approfondire la stima del rischio tra i lavoratori esposti Co e carburi di W Goldoni et al., 2004), il progetto di ricerca prevede un'ulteriore applicazione dell'analisi del CAE in una coorte (N° 150 soggetti) di lavoratori professionalmente esposti a metalli duri. Particolare peculiarità di questa coorte di lavoratori [che saranno reclutati in USA dal National Institute of Occupational and Health Safety (NIOSH)], è la presenza di un certo numero di casi clinici d'asma professionale. Sarà quindi eseguita una specifica valutazione per indagare correlazioni tra i classici indicatori clinici d'asma professionale ed i biomarkers quantificabili a livello del CAE.

Inoltre, l'unità di Parma metterà a disposizione di tutte le altre Unità Operative (responsabili del reclutamento di soggetti con altre pneumopatie quali l'asma e la BPCO) le potenzialità analitiche del Laboratorio di Tossicologia Industriale, con particolare riferimento alla cromatografia liquida accoppiata con spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS), alle tecniche di biologia molecolare (reazione polimerasica a catena in tempo reale) e d'immunochimica.


Materiali e Metodi

Soggetti

In questo studio osservazionale, che sarà sottoposto all'approvazione del Comitato Etico della Facoltà di Medicina e Chirurgia dell'Università degli Studi di Parma, il reclutamento sarà su base volontaria ed i volontari forniranno il loro consenso informato dopo aver appreso in dettaglio i presupposti e le finalità dello studio, nonché le manovre strumentali ed i prelievi di campioni biologici da effettuare.

Lo studio su lavoratori esposti a Cr sarà effettuato su circa 50 soggetti, impiegati in aziende dove viene effettuata cromatura a spessore e decorativa.

I lavoratori esposti a metalli duri saranno reclutati in USA presso il National Institute of Occupational and Health Safety (NIOSH)]. Si prevede di reclutare circa 150 soggetti.


Disegno dello studio

Lo studi sarà di tipo trasversale. I lavoratori delle cromature del parmense saranno valutati a tre tempi: all'inizio ed alla fine di un giorno feriale e dopo 48 ore d'astensione dal lavoro. La necessità di eseguire i campionamenti a tre tempi è necessaria per meglio capire la cinetica delle sostanze inalate.

Per motivi logistici ed anche in considerazione della diversa numerosità del campione (150 soggetti), nonché in considerazione del fatto che le informazioni sulla cinetica sono già state ottenute in occasione di un nostro precedente lavoro pubblicato, lo studio sui lavoratori americani esposti a metalli duri prevede un solo campionamento, al termine di un normale turno lavorativo infrasettimanale.

Metodi
I soggetti saranno valutati con i seguenti accertamenti: 1) raccolta urine, 2) raccolta CAE, 3) spirometria: 4) prelievo di sangue venoso.

1. raccolta di urine: sarà raccolto un campione in estemporanea di urine e saranno successivamente stoccate aliquote da 5 ml in provette di polipropilene e congelate a -20° C;
2. raccolta del CAE sarà utilizzato un apposito condensatore (TurboDeccs, Italchil, Parma) in grado di regolare e di mantenere costante la temperatura di condensazione durante il test. A ciascun soggetto sarà chiesto di respirare normalmente per 15 minuti, senza l'uso di uno stringinaso, attraverso un boccaglio personale e sterile, connesso allo strumento e dotato di una doppia valvola per la separazione dei flussi inspiratori ed espiratori e l'intrappolamento della saliva. L'aria esalata è convogliata in un circuito di respiratorio che è raffreddato ad una temperatura di -5 °C, permettendo così la condensazione del vapore acqueo presente nell'aria espirata. In queste condizioni, respirando a volume corrente per circa 15 minuti, si raccolgono campioni di 3-4 ml di EBC; questi sono poi conservati a -80° C, per essere poi analizzati.
3. prelievo di sangue venoso: sarà eseguito un prelievo di sangue venoso (10 ml), poi aliquotati in provette contenenti EDTA che saranno poi conservate a -80°C; in parte, il sangue sarà centrifugato a 2.500 giri per 10 minuti e saranno stoccate varie aliquote di 0,2 ml di siero e conservate in provette di polipropilene a –20°C;
4. spirometria: la spirometria sarà eseguita tramite pneumotacografo (Koko, Sensor Medics, Milano) connesso con un personal computer, e si prevede di misurare la FVC, il FEV1, FEV1/FVC % e PEF. Dopo adeguata istruzione e in accordo con le procedure di standardizzazione per l'esecuzione della manovra di FVC, le rilevazioni saranno effettuate dopo avere ottenuto per ciascuna delle manovre almeno tre misurazioni del FEV1 e FVC ripetibili tra loro (variabilità inferiore 100 ml).

Sulle matrici biologiche raccolte saranno eseguite le seguenti determinazioni:

1. urine: A livello urinario sarà eseguita la determinazione di metalli utilizzando metodiche di riferimento che prevedono come sistema di rilevazione la spettrometria di massa, quali la spettroscopia di emissione atomica con sorgente a plasma ad accoppiamento induttivo e rilevazione in spettrometria di massa (ICP-MS). A livello urinario saranno inoltre determinate la 8-idrossi-2'-desossiguanosina e la corrispondente base non modificata con una nuova metodica basata sull'impiego della tecnica cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS). Gli analiti verranno separati mediante una colonna per cromatografia a fase inversa (Atlantis dC18, 100 x 3 mm i.d., 3 um) utilizzando una fase mobile composta da ammonio formiato (10 mM, pH 3,75) e metanolo in gradiente di eluizione. La ionizzazione degli analiti sarà ottenuta in positivo mediante interfaccia Turboionspray. Per la rivelazione sarà impiegata la modalità denominata selected-reaction monitoring (SRM), la più sensibile e selettiva in MS/MS.
2. CAE: per l'analisi CAE saranno utilizzate metodiche di riferimento che prevedono come sistema di rilevazione la spettrometria di massa, quali ICP-MS, grazie alla collaborazione dell'Unità di Brescia, ed LC-MS/MS, disponibile invece nel nostro laboratorio. La tecnica ICP-MS sarà utilizzata per la quantificazione di metalli tossici presenti nel fumo di sigaretta e negli ambienti di lavoro. La tecnica HPLC e LC-MS/MS saranno utilizzate per la determinazione di indicatori di stress ossidativo (acqua ossigenata, aldeidi, glutatione etc.), nonché di infiammazione (leucotrieni, proteine, ammonio etc.) e di metabolismo polmonare.
3. Il sangue sarà utilizzato per eseguire il dosaggio del Cr a livello di globuli rossi e plasma. I gruppi carbonilici nel siero saranno stimati in assorbanza a 365 nm.