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INIZIO_TESTO_DA_INDICIZZARE

UNITA' DI RICERCA

italiano - english
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Programma di ricerca

Metodi non invasivi per lo studio delle basi biologiche e fisiopatologiche delle malattie respiratorie: applicazioni cliniche ed epidemiologiche.
Università di riferimento
Università degli Studi di SIENA - FISIOPATOLOGIA, MEDICINA SPERIMENTALE E SANITA' PUBBLICA - SIENA(SI)
Responsabile dell'Unità di ricerca
Mario COMPORTI
Descrizione
Da quanto sopra detto sembrerebbe che i marker più specifici di stress ossidativo polmonare siano gli F2-isoprostani e soprattutto gli E2-isoprostani. Pertanto ci proponiamo di valutare l'8-iso-PGF2alfa e l'8-iso-PGE2 prima in animali sperimentalmente intossicati con bleomicina, che induce, come sopra detto, una fibrosi polmonare e poi in soggetti esposti ad ambienti ricchi di particolato con o senza patologie polmonari.
1) a) Valutazione del 8-iso-PGF2alfa e del 8-iso-PGE2 nel plasma, nelle urine e soprattutto nel liquido di lavaggio bronchiale (BAL) di ratti intossicati con bleomicina (per le modalità di intossicazione si rimanda alle referenze).
b) Per essere certi che la produzione di isoprostani si origini nel polmone, valuteremo gli isoprostani ancora esterificati ai fosfolipidi polmonari e inoltre gli isoprostani esterificati ai fosfolipidi di altri tessuti, come quello epatico e quello renale.
c) Valuteremo la eventuale correlazione fra isoprostani e collageno polmonare, valutato sia come contenuto (contenuto di idrossiprolina), sia come sintesi (mRNA con Northen blotting o con RT-PCR).
2) Valutazione degli isoprostani nell'espirato condensato ed inoltre nel plasma e nelle urine di soggetti con varie patologie polmonari infiammatorie o neoplastiche provenienti dalle Unità Operative di Parma, Padova e Pisa, in particolare pazienti con asma o broncopatia cronica ostruttiva, ARDS, fibrosi cistica od altre patologie polmonari; inoltre di soggetti esposti a fumo di sigaretta e ozono.
Gli isoprostani da determinare sono il 8-iso-PGE2 e il 8-iso-PGF2alfa. Il rapporto fra i due composti potrebbe correlarsi al grado di spasmo delle vie aeree (prevalenza di 8-iso-PGE2) o di fenomeni infiammatori (prevalenza di 8-iso-PGF2alfa).
Se fosse possibile avere la disponibilità di alcuni BAL, sarebbe particolarmente utile studiare la componente cellulare sia dal punto di vista morfofunzionale, sia dal punto di vista delle vie di trasduzione di segnale eventualmente messe in atto dagli isoprostani medesimi (vedi sotto).
3) Siccome in precedenti studi non ancora pubblicati abbiamo osservato che nelle cellule epatiche stellate (HSC) in coltura gli F2-isoprostani inducono un drammatico aumento della sintesi di DNA (incorporazione di timidina triziata), un aumento della sintesi del collagene (incorporazione di prolina triziata) senza influire sulle proteine non collageniche ed un aumento del contenuto totale di collagene, oltre ad una aumentata formazione di TGFbeta, intendiamo vedere gli effetti degli stessi isoprostani sui fibroblasti polmonari. Come sopra detto, infatti, vi sono delle profonde affinità morfofunzionali fra le HSC e quella piccola frazione di fibroblasti polmonari che è capace di differenziarsi in cellule "myofibroblast like".
I fibroblasti saranno isolati dal polmone di ratto con le metodiche già in atto nel nostro laboratorio (55). Una parte delle colture verranno trattate con gli F2-isoprostani (inizialmente con l'8-iso-PGF2alfa, ma poi anche con altri isoprostani) nei primi giorni di coltura per vedere se gli isoprostani siano in grado di intervenire sulla eventuale trasformazione dei fibroblasti nel fenotipo "myofibroblast-like". Tale fenotipo sarà evidenziato dalla comparsa dei soliti marcatori, e cioè filamenti di SMA, e/o di filamenti di desmina. Se, come è probabile, non sarà possibile osservare tale trasformazione fenotipica partendo da fibroblasti normali, allora si partirà da fibroblasti ottenuti da ratti trattati con bleomicina, nei quali, come si è detto sopra, sono visibili già ai primi giorni di trattamento miofibroblasti esprimenti la SMA e la desmina. Potremo allora vedere se gli isoprostani accelerino la trasformazione fenotipica e l'espressione del mRNA per il procollagene.
Tali esperimenti verranno ripetuti con colture di fibroblasti arrivati alla maturità (confluenza o subconfluenza). Questi esperimenti in vitro saranno accompagnati da esperimenti in vivo con ratti trattati con bleomicina, per avere una idea ben precisa dei livelli di isoprostani che si possono ottenere nel plasma in questa intossicazione.
4) I fibroblasti in coltura alla confluenza verranno trattati con F2-isoprostani, nel range delle concentrazioni ritrovate in vivo, per vedere se tale trattamento influisca: a) sulla sintesi del DNA (misurata dalla incorporazione di timidina triziata); b) sulla sintesi di collagene (incorporazione della prolina triziata nelle proteine collageniche, tenendo ovviamente in conto l'incorporazione nelle proteine non collageniche); c) sulla sintesi netta del collagene (valutata con la comune reazione con il Sirius Red); d) sulla espressione del mRNA per il procollagene; e) sulla espressione del mRNA per il TGF-beta; f) le vie di segnalazione intracellulare con particolare riguardo alle Smad 3 e Smad 2 proteins.
5) I BAL ottenuti da ratti (topi) trattati con bleomicina verranno saggiati per il contenuto di TGF-beta e le cellule ottenute dopo centrifugazione (macrofagi alveolari, monociti, granulociti) verranno esaminate per:
a) l'espressione di citochine (TGF-beta, TNF-alfa, IL-1, ecc.); per il rilascio di enzimi degradanti la matrice (metallo-proteasi) e per l'espressione di inibitori delle metalloproteasi.
b) la produzione di ROS, essenzialmente anione superossido, rivelabili per chemiluminescenza. La determinazione sarà effettuata anche dopo aggiunta di 8-iso-PGF2alfa allo scopo di indagare un'eventuale azione amplificativa di feed back della produzione degli isoprostani, essendo questi generalmente prodotti in maniera non significativa dall'azione della cicloossigenasi.
c) il sopranatante dei BAL verrà saggiato sulle colture di fibroblasti per valutare i principali parametri fibrotici (proliferazione cellulare, sintesi e deposizione di collagene).