RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Metodi non invasivi per lo studio delle basi biologiche e fisiopatologiche delle malattie respiratorie: applicazioni cliniche ed epidemiologiche.

Università di riferimento

Università degli Studi di PADOVA - MEDICINA AMBIENTALE E SANITA' PUBBLICA - PADOVA(PD)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Piero MAESTRELLI

Descrizione

Ipotesi

In questo studio si ipotizza che la risposta acuta delle vie aeree a stimoli infiammatori sia caratterizzata da un particolare profilo dei mediatori liberati dall'epitelio bronchiale, quantificabili nel condensato dell'aria espirata e nell'espettorato indotto, e dei composti volatili esalati. I modelli su cui si intende provare questa ipotesi sono la reazione asmatica acuta indotta sperimentalmente dalla inalazione di isocianati in soggetti sensibilizzati e la reazione acuta in fase di riacutizzazione della malattia in soggetti con BPCO.
La sensibilizzazione ad isocianati rappresenta la più frequente causa di asma professionale ed offre dei vantaggi rispetto all'asma non professionale. Infatti, in questo tipo di asma non vi è l'interferenza del fattore atopia perché insorge in soggetti non atopici; la causa dell'asma è un agente preciso, ben identificabile; l'esposizione all'agente causale può essere controllata accuratamente perché è misurabile durante il test di esposizione sperimentale in laboratorio e si possono escludere altre fonti di esposizione una volta che il paziente è stato allontanato dall'ambiente di lavoro.
Le cause più frequenti di riacutizzazioni di BPCO sono infezioni dell'albero tracheobronchiale (22). L'identificazione se l'agente eziologico è batterico o virale può avere implicazione per il trattamento dell'esacerbazione, ma spesso non è agevole. Si ipotizza tuttavia che il profilo di mediatori e composti volatili caratteristici della risposta acuta delle vie aeree sia diverso in caso di infezione virale o batterica.

Disegno generale

FASE 1: standardizzazione delle metodiche di condensazione e campionamento aria espirata
Le variabili ventilatorie e quelle legate alla temperatura di condensazione verranno analizzate e standardizzate fra le unità operative partecipanti al progetto; come pure l'apparecchiatura e le modalità di conservazione dei campioni. Verrà inoltre stabilito un protocollo comune per la raccolta e conservazione dell'aria espirata.

FASE 2: monitoraggio della risposta acuta nell'asma
Verranno confrontati due gruppi di soggetti:
- pazienti con asma professionale da isocianati
- controlli non sensibilizzati ad isocianati
Ogni soggetto verrà sottoposto all'esposizione sperimentale in laboratorio a concentrazioni non irritanti di isocianati (TDI, MDI o HDI) e a placebo (aria) in giorni diversi, in singolo cieco.
La funzione respiratoria e le concentrazioni di NO esalato verranno monitorate per 24 ore dopo ogni esposizione (ad isocianati e a placebo).
Il condensato dell'aria espirata verrà raccolto prima di ogni esposizione e dopo 1 ora, 3 ore, 24 ore.
L'aria esalata verrà raccolta agli stessi tempi.
L'espettorato verrà indotto 24 ore prima e 24 ore dopo l'esposizione ad isocianati; agli stessi tempi verranno raccolti campioni di saliva, urine e sangue venoso.

Analisi del condensato:
- pH
- prodotti di perossidazione membrane lipidiche
- metaboliti acido arachidonico
- "proteomic analysis"

Analisi dell'espettorato indotto:
- cellularità totale
- conta differenziale cellule infiammatorie
- prodotti di perossidazione membrane lipidiche
- metaboliti acido arachidonico
- "proteomic analysis"

Analisi della saliva:
- prodotti di perossidazione membrane lipidiche
- metaboliti acido arachidonico
- "proteomic analysis"

Analisi del siero e delle urine:
- Clara Cell secretory protein (CC16)

Analisi della aria esalata
- Verranno quantificati i composti organici volatili

FASE 3: monitoraggio della risposta acuta nella BPCO
I soggetti con riacutizzazione di BPCO verranno monitorati in tre occasioni: in fase acuta, al termine della riacutizzazione e in fase stabile dopo almeno un mese dalla riacutizzazione. In ogni occasione a ciascun soggetto verranno prelevati campioni di condensato dell'aria espirata, di espettorato, di aria esalata, di sangue venoso e di urine.

Analisi del condensato:
- pH
- prodotti di perossidazione membrane lipidiche
- metaboliti acido arachidonico
- proteomic analysis

Analisi dell'espettorato:
- esame microbiologico per valutare la presenza di infezioni virali o batteriche

Analisi del siero e delle urine:
- Clara Cell secretory protein (CC16)

Analisi della aria esalata
- Verranno quantificati i composto organici volatili

Casistica e metodi

Soggetti:
Risposta acuta nell'asma
Verranno studiati due gruppi di pazienti:
- 10 soggetti con asma professionale da isocianati
- 10 soggetti di controllo esposti ad isocianati ma non sensibilizzati
Tutti i soggetti con sintomi compatibili con asma bronchiale legati all'esposizione professionale a isocianati, dovranno aver sospeso da almeno un mese la terapia cortisonica e con 2 agonisti a lunga durata d'azione e non presentare infezioni respiratorie recenti. La diagnosi di asma da isocianati verrà confermata tramite test di stimolazione bronchiale specifico.

Risposta acuta nella BPCO
Verranno studiati soggetti con BPCO in fase stabile e durante una riacutizzazione della malattia che ha determinato ricovero presso il Dipartimento di Medicina Clinica e Sperimentale, Sezione di Malattie dell'Apparato Respiratorio, Università degli Studi di Ferrara.
La diagnosi di BPCO verrà formulata secondo i criteri GOLD (22).

Test di funzionalità respiratoria
I volumi polmonari mobilizzabili saranno misurati secondo le direttive dell'E.R.S. (European Respiratory Society) (23) mediante uno spirometro a secco. Verranno utilizzati i valori migliori di capacità vitale forzata (CVF) e volume espiratorio massimo in un secondo (VEMS) ottenuti da 3 prove effettuate per ogni soggetto. Verranno utilizzati come valori teorici i valori normali predetti dalla Communité Européenne du Carbon et de Acièr (CECA 71) (24).

Test di provocazione bronchiale specifico
Il Test verrà eseguito esponendo il paziente a isocianati (TDI o MDI o TDI) per 30 minuti, monitorando il FEV1 prima del test, dopo 15 e 30 minuti dall'esposizione e poi ad intervalli regolari di 1 ora per 7 ore. Il giorno precedente il test, il paziente verrà esposto a placebo con controllo del FEV1 a 15 e 30 minuti dall'esposizione e poi ad intervalli regolari di 1 ora per 7 ore (25).

Misurazione dell'NO
La misurazione dell'NO verrà eseguita mediante un analizzatore a chemiluminescenza secondo le raccomandazioni dell'European Respiratory Society (17).

Raccolta condensato
Il condensato dell'aria espirata verrà ottenuto facendo respirare il paziente per 15 minuti in un apposito condensatore. Il condensato verrà suddiviso in diverse aliquote conservate a -80°C per le misure successive (26).

Raccolta dell'espettorato indotto
L'espettorato verrà indotto facendo inalare ai soggetti, tramite un nebulizzatore ultrasonico, soluzioni di cloruro di sodio (3%-4%) per 20 minuti (18). Per controllo della contaminazione salivare, campioni di saliva verranno raccolti su una capsula Petri sterile.

Raccolta di campioni di sangue venoso e di urina
Verranno prelevati dai soggetti a digiuno campioni di sangue venoso e campioni di urina.

Raccolta dell'aria espirata
Verrà eseguita come descritto da Corradi et al. (21).

Misura pH condensato
La misura del pH del condensato verrà eseguita subito dopo la raccolta di quest'ultimo grazie ad un pH-metro con elettrodo appropriato dopo degassazione con gas inerte (Argon) per eliminare l'anidride carbonica e stabilizzare il pH (27).

Misura della cellularità totale e conta differenziale delle cellule infiammatorie dell'espettorato
Verrà effettuata la selezione dei frustoli dalla saliva e i campioni verranno omogeneizzati per ottenere la sospensione cellulare. Il campione verrà quindi citocentrifugato e i vetrini allestiti verranno congelati a –80 °C fino al momento della colorazioni con Diff-Quik per procedere alla conta differenziale dei leucociti (28)

Misura di prodotti di perossidazione membrane lipidiche
La misura di aldeidi e 8-isprostano verrà eseguita con spettrometria di massa dalle Unità operative di Parma e Siena (29).

Misura dei metaboliti dell'acido arachidonico (LTB4)
La misura di LTB4 verrà eseguita tramite metodo immunoenzimatico (EIA, Cayman Chemical, Ann Arbor, MI) (30).

Misura della Proteina CC16
La determinazione quantitativa di CC16 verrà eseguita tramite metodo immunoenzimatico (31).

Proteomic analysis
L'analisi proteomica verrà eseguita utilizzando la tecnica dell'elettroforesi bidimensionale e la spettrometria di massa (32).

Analisi dei composti volatili
Verrà eseguita come descritto da Corradi et al. (21).