RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Metodi non invasivi per lo studio delle basi biologiche e fisiopatologiche delle malattie respiratorie: applicazioni cliniche ed epidemiologiche.

Università di riferimento

Università di PISA - CARDIO TORACICO - PISA(PI)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Pierluigi PAGGIARO

Descrizione

SCOPO DELLO STUDIO
Scopo di questo studio è la ricerca della validazione di alcuni marcatori biologici di infiammazione e/o di ossidazione rilevabili nel condensato dell'aria espirata, sia attraverso valutazioni intrinseche alla misura (ripetibilità, sensibilità, accuratezza) sia attraverso correlazioni con indici clinico-funzionali ed altri indicatori biologici dell'asma, misurabili con tecniche note e già standardizzate. In questo modo, l'obiettivo è di tentare di dare un significato all'utilizzo diagnostico della raccolta del condensato nell'asma, facendo particolare attenzione a quei mediatori che dalla letteratura risultano essere più specifici per questa patologia e sensibili alle variazioni del processo infiammatorio (in corso di riacutizzazioni o ad opera del trattamento farmacologico) quali 8-isoprostano, leucotrieni, malondialdeide, nitrotirosina.
Lo studio prevede quindi due obiettivi:
a) validazione della metodologia di raccolta e di misura dei marcatori di stress ossidativo e dei leucotrieni nel condensato
b) confronto tra i dati ottenuti dall'analisi del condensato con i dati biologici e clinico-funzionali ottenibili con altre tecniche più standardizzate (esame dell'espettorato indotto e misura dell'ossido nitrico nell'esalato)
Per monitorare le variazioni dei marcatori biologici al variare delle condizioni clinico funzionali, verranno selezionati soggetti asmatici a cui verrà indotto il broncospasmo tramite esposizione all'allergene specifico o ad ozono (0.2-0.3 ppm in camera di esposizione), secondo protocolli ben standardizzati e collaudati nel nostro laboratorio.

SOGGETTI E PROTOCOLLO DI STUDIO
Soggetti con asma lieve o moderato persistente, stabili con o senza terapia farmacologia regolare, verranno selezionati dall'ambulatorio dell'asma e richiesti per la loro disponibilità a far parte dello studio. Verrà richiesto un consenso informato.
Saranno studiati due gruppi di soggetti: a) 12 soggetti con asma persistente di grado lieve o moderato, in regolare terapia farmacologia con corticosteroidi inalatori, associati o no a broncodilatatori a lunga durata d'azione, con FEV1 superiore all'80% del predetto, atopici e con cutisensibilizzazione ad uno o più allergeni ubiquitari; b) 12 soggetti con asma persistente di grado lieve, non in terapia regolare con corticosteroidi inalatori, con FEV1 superiore al 80% del predetto.
Il primo gruppo sarà sottoposto a test di provocazione bronchiale con l'allergene specifico, dopo un periodo di almeno 2 settimane di sospensione della terapia con corticosteroidi inalatori. Il giorno precedente il test, il paziente effettuerà la raccolta del condensato dell'aria espirata, la misurazione dell'ossido nitrico nell'aria esalata, la misurazione della reattività bronchiale non specifica alla metacolina, e la raccolta dell'espettorato indotto. Il giorno del test il paziente sarà sottoposto all'inalazione dello specifico allergene, secondo protocollo standardizzato, fino alla comparsa della reazione immediata (riduzione del FEV1 tra il 25 e il 35% rispetto al basale). Dopo l'avvenuto recupero spontaneo della risposta immediata, verrà nuovamente effettuata la misura del condensato dell'aria espirata e la misurazione dell'ossido nitrico nell'aria esalata. Il paziente verrà poi monitorato relativamente al FEV1 fino alla 8a ora dall'inalazione dell'allergene, per valutare la possibile comparsa di una risposta ritardata. Alla fine dell'8a ora, verranno ripetute le misure sul condensato, sull'esalato e sull'espettorato indotto. Il giorno successivo il paziente ripeterà le misure spirometriche e tutte le misurazioni effettuate il giorno precedente l'esposizione all'allergene.
Il secondo gruppo di pazienti sarà sottoposto ad esposizione ad ozono in laboratorio, secondo un protocollo già ampiamente standardizzato ed utilizzato. Il giorno precedente il test, il paziente effettuerà la raccolta del condensato dell'aria espirata, la misurazione dell'ossido nitrico nell'aria esalata, la misurazione della reattività bronchiale non specifica alla metacolina, e la raccolta dell'espettorato indotto. Il giorno successivo, in una camera di esposizione, il paziente sarà esposto a 0.2-0.3 ppm di ozono per 2 ore, con lieve esercizio intermittente. Alla fine dell'esposizione, verrà misurata la funzione polmonare e verrà campionato il condensato dell'aria espirata e l'ossido nitrico esalato. Dopo 6 ore dalla fine dell'esposizione, tutte le misure effettuate il giorno precedente il test verranno ripetute.

METODI
Camera di esposizione ad ozono
I soggetti saranno esposti per 120 minuti in una camera diesposizione di 9m cubi fatta di vetro e alluminio (1), mentre si eserciteranno su un cicloergonometro per 20 minuti ogni ora. L'ozono sarà generato da un generatore a corona (Rancon Instruments SpA, Milano, Italia), connesso ad un cilindro di aria pura. Il flusso di ozono nella camera sarà di 0.5 l/min e sarà modificato secondo i livelli misurati nella camera di esposizione. Un analizzatore di O3 (Photometric O3 analyzer 400, Rancon Instruments SpA, Milano, Italia) sarà connesso alla camera con un circuito di tubi, e misurerà continuamente la concentrazione di ozono nella camera. La concentrazione sarà tenuta intorno a 0.2-0.3 ppm. Un ventilatore nella camera assicurerà l'adeguato mescolamento dei gas e la loro circolazione.
Test di provocazione bronchiale specifico con allergene
I test di broncostimolazione specifica verranno effettuati utilizzando allergeni standardizzati in UB (Unità Biologiche). Soluzioni con estratti di allergene saranno erogate con un nebulizzatore Devilbiss 646 (DeVilbiss Health Care, Somerset, Mass., USA), connesso ad un dosimetro a aria compressa (Rosenthal; Louisville, Co, USA) secondo una procedura ben standardizzata (2). Estratti liofilizzati di allergene (Alkabellò, Milano, Italia) saranno disciolti in soluzione salina fisiologica in modo da ottenere due diverse concentrazioni (1 e 10 BU/ml). Ogni soggetto, tenendo apposito stringinaso, effettuerà l'inalazione dell'allergene partendo da CFR. Il nebulizzatore sarà riempito con 3 ml di soluzione di allergene o diluente. Dopo la valutazione basale, il paziente inalerà tre puffs di diluente, seguiti ogni 10 minuti, da dosi crescenti di allergene (da 0.02 a 3.2 BU). Il FEV1 sarà misurato 10 min dopo la fine di ogni inalazione con uno spirometro a campana connesso ad un PC (Biomedin; Padova, Italia). Le inalazioni continueranno fino a quando non si avrà una caduta del FEV1 pari o superiore al 20% del valore basale, o fino a quando sarà stata erogata l'ultima dose di allergene. Successivamente il FEV1 verrà misurato ripetutamente dopo 20, 30 e 60 minuti, e infine dopo 2,3,4,5,6,7 e 8 ore dall'ultima dose di allergene erogata, allo scopo di verificare la presenza di una eventuale reazione ritardata. La risposta immediata sarà espressa dalla dose provocativa di allergene (PD20FEV1 allergene), mentre la risposta ritardata verrà espressa sia dal massimo decremento del FEV1 tra la 2° e la 8° ora che dall'area sottesa dalla curca FEV1-tempo.
Test dell'espettorato indotto
La induzione e il trattamento dell'espettorato indotto: verranno effettuati secondo un metodo standardizzato e pubblicato (3, 4). L'espettorato verrà indotto tramite inalazione di soluzione salina ipertonica (4.5%) per 3 periodi di 5 min ciascuno, con un nebulizzatore ad ultrasuoni (portata: 2.8 ml/min; Sirius, Technomed, Firenze, Italia). Preliminarmente verrà misurato il FEV1 basale e verrà somministrato un broncodilatatore, per impedire una eccessiva broncocostrizione. Ogni 5 min il paziente verrà invitato a espettorare in un recipiente pulito, dopo sciacquato la bocca per eliminare la saliva presente nel cavo orale. La nebulizzazione verrà interrotta dopo 15 minuti di somministrazione o se si osserva una caduta del VEMS pari al 20% o più del valore basale (4). I tappi di muco presenti nel campione di espettorato raccolto, saranno isolati mediante apposite pinzette per minimizzare la contaminazione salivare. Il materiale così selezionato sarà pesato, diluito 1:4 con ditiotreitolo (DTT) 0.1% (Sputasol; Unipath Ltd, Basingstoke, UK) per la fluidificazione dei tappi di muco, e incubato, in bagnetto termostatato con agitatore, a 37° C per circa 10 minuti. La sospensione sarà poi ulteriormente diluita con PBS, ottenendo così una diluizione finale di 1: 20, centrifugata a 450 g per 10 minuti. Il sovranatante raccolto sarà congelato a -30° C e successivamente utilizzato per la misurazione dei vari mediatori. Il pellet cellulare sarà risospeso in 1 ml di PBS e utilizzato per la misura della vitalità cellulare (Trypan blue) e della cellularità totale (colorazione di Turk); la sospensione cellulare sarà poi diluita per ottenere una concentrazione di 0.75-1.0x106 cellule/ml e aliquote saranno citocentrifugate (Cytospin; Shandon Scientific, Sewickly, PA, USA) e colorate con Diff-Quik (Baxter Scientific Products, Miami, FL, USA) per l'allestimento dei vetrini per la conta differenziale. La percentuale di macrofagi, linfociti, eosinofili e neutrofili sarà espressa come per cento del totale delle cellule infiammatorie, escludendo le cellule squamose. I vetrini di scarsa qualità o nei quali non sara' possibile contare almeno 300 cellule infiammatorie verranno scartati.
Misura del monossido di azoto (NO) nell' aria esalata
L'NO verrà misurato nell'aria espirata, usando un analizzatore rapido di NO (NO analyser NOA, Sievers 280) secondo un protocollo standardizzato (5). Il paziente effetuerà una singola lenta manovra di espirazione, della durata di 30-45 secondi, contro una modesta resistenza, e la concentrazqione di NO alla bocca sarà registrata durante tutta la fase espiratoria. Il valore di NO nella fase terminale dell'espirazione sarà misurato. Verranno effettuate almeno tre manovre accettabili con una variazione del valore di NO inferiore al 10%, e verrà considerato il valore più alto.
Raccolta del condensato dell'aria espirata
Per la raccolta del condensato sarà utilizzato uno speciale condensatore, che raffredda l'aria espirata fino a condensarla (Ecoscreen, Jaeger Wurzburg, GE). I pazienti, dopo aver sciacquato la bocca, dovranno, seduti in poltrona, respirare spontaneamente attraverso un boccaglio a due vie collegato al condensatore per 15 minuti (6). Il liquido raccolto sarà aliquotato, stoccato a -80°C, ed utilizzato per la misurazione dei vari mediatori. Durante la raccolta del condensato, verrà misurata la ventilazione esterna ed il pattern respiratorio (volume corrente e frequenza respiratoria) attraverso uno pneumotacografo applicato al boccaglio del condensatore.
Misurazione mediatori solubili
Indicatori di attivazione neutrofilica e/o eosinofilica
La mieloperossidasi (MPO) sarà misurata nel condensato e nel supernatante dell'espettorato con sistemi radioimmunologici disponibili in commercio (Pharmacia, Uppsala, Sweden).
La proteina cationica degli eosinofili (ECP) sarà misurata nel condensato e nel supernatante dell'espettorato con tecnica fluoroimmunoenzimatica disponibile in commercio (Pharmacia, Uppsala, Sweden).
L'attività dell'elastasi neutrofilica (NE) presente nel condensato e nel supernatante dell'espettorato sarà misurata con metodo spettrofotometrico, usando un substrato sintetico methoxysuccinyl-ala-ala-pro-val-paranitroanilide (MeOSAAPVpNa) (Sigma ALDRICH Company Ltd. Poole, Dorset, UK).
Citochine. I livelli di IL-5 e IL-8 nel condensato e nel supernatante dell'espettorato saranno determinati con kit ELISA disponibili in commercio, in accordo con i protocolli raccomandati dalle ditte produttrici.
Leucotrieni. Le concentrazioni di LTB4 e Cys-LTS nell'espettorato e nel condensato saranno determinate con metodo immunoenzimatico, previa separazione in HPLC. Questa metodica, in corso di messa a punto nel nostro laboratorio, sarà ulteriormente valicata con test di sensibilità, ripetibilità ed accuratezza.
Indicatori di stress ossidativi 8-isoprostano e 3-nitrotirosina saranno misurati nell'espettorato e nel condensato con kit ELISA disponibili in commercio, in accordo con i protocolli raccomandati dalle ditte produttrici. I livelli di malondialdeide (MDA) nell'espettorato e nel condensato saranno determinati usando il sistema High Performance Liquid Cromatography (HPLC) con detector a fluorescenza, mediante derivatizzazione con acido tiobarbiturico (TBA). Queste metodiche sono già state messe a punto nel nostro laboratorio, e saranno ulteriormente validate con test di sensibilità, ripetibilità ed accuratezza.

RISULTATI PREVISTI
Il progetto potrà fornire indicazioni sui seguenti punti:
a) la raccolta del condensato dell'aria espirata, in condizioni basali e dopo stimoli vari, permette di misurare concentrazioni apprezzabili di mediatori indicativi di infiammazione bronchiale e/o di stress ossidativi nell'asma? i test analitici disponibili sono sufficientemente sensibili per apprezzare variazioni di questi indicatori in relazione alla comparsa di alterazioni clinico-funzionali e biologiche (come dimostrate da altri indicatori più standardizzati)?
b) qual'è la variabilità spontanea delle misurazioni di questi mediatori nel condensato, e quanto queste variazioni sono sensibili ad interferenze legate alla tecnica di raccolta (tempo di raccolta, ventilazione polmonare, modello di respiro)?
c) quali correlazioni esistono tra le variazioni misurabili nel condensato e quelle degli stessi indicatori misurabili ad es. nel supernatante dell'espettorato indotto?
d) qual è la potenziale utilità di questa metodica nello studio degli eventi clinico-funzionali e biologici dell'asma?