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UNITA' DI RICERCA
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Bibliografia
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Programma di ricerca
METABOLISMO LOCALE ED ESPRESSIONE GENICA: NUOVE PROSPETTIVE IN CHIRURGIAUniversità di riferimento
Università degli Studi INSUBRIA Varese-Como - SCIENZE CHIRURGICHE - VARESE(VA)Responsabile dell'Unità di ricerca
Renzo DIONIGIDescrizione
Una prima fase del progetto prevede mettere a punto il modello sperimentale di epatectomia nel ratto, verificare la la possibilità di misurazione dei parametri in studio (RLO, piruvati, lattati, glicerolo, glucosio e fattori di crescita) a livello di liquido interstiziale prelevato con microdialisi.Vengono impiegati per le esperienze ratti Wistar maschi del peso compreso fra 250 e 300 g, stabulati da una settimana e nutriti con pellettato standard (Purina Rat Chow) ed acqua «ad libitum».Gli interventi vengono eseguiti nelle stesse ore predeterminate per evitare alterazioni del ritmo circadiano.
I ratti vengono randomizzati in 6 gruppi (totale 130 ratti), come segue.
Gruppo A:(N=10) controllo per i valori normali: laparotomia mediana, manipolazione del fegato e dell'ilo epatico senza epatectomia, posizionamento delle sonde da microdialisi a livello del lobo mediano destro e prelievo del liquido interstiziale per 30 minuti per il dosaggio di RLO, piruvati, lattati, glicerolo, glucosio e fattori di crescita
Gruppo B: (N=24) laparotomia mediana, mobilizzazione del fegato, epatectomia del 70% senza ischemia e successivo inserimento delle sonde da microdialisi a livello del lobo laterale destro. Risveglio degli animali e prelievo del liquido interstiziale mediante microdialisi per dosaggio di RLO, piruvati, lattati, glicerolo, glucosio e fattori di crescita per 24 ore (12 ratti) e 72 ore (12 ratti). Successivo sacrificio degli animali con prelievo del fegato rigenerato per misurazione quantitativa della rigenerazione.
Gruppo C: (N=24) laparotomia mediana, mobilizzazione del fegato, posizionamento di sonda da microdialisi a livello del lobo mediano destro e del lobo laterale destro. Ischemia ilare epatica completa di 10' durante la quale verranno dosati RLO, piruvati, lattati, glicerolo, glucosio e fattori di crescita a livello del liquido interstiziale. Rimozione della sonda a livello del lobo mediano destro e, quindi, epatectomia del 70%. Risveglio degli animali e prelievo del liquido interstiziale mediante microdialisi per dosaggio di RLO, piruvati, lattati, glicerolo, glucosio e fattori di crescita per 24 ore (12 ratti) e 73 ore (12 ratti) mediante la sonda inserita nel lobo laterale destro. Successivo sacrificio degli animali con prelievo del fegato rigenerato per misurazione quantitativa della rigenerazione..
Gruppo D: (N=24) laparotomia mediana, mobilizzazione del fegato, posizionamento di sonda da microdialisi a livello del lobo mediano destro e del lobo laterale destro. Successiva ischemia ilare completa intermittente di 5', riperfusione di 5' per 3 volte per un totale di minuti 15' durante la quale verranno dosati RLO, piruvati, lattati, glicerolo, glucosio e fattori di crescita a livello del liquido interstiziale. Rimozione della sonda a livello del lobo mediano destro e, quindi, epatectomia del 70%. Risveglio degli animali e prelievo del liquido interstiziale mediante microdialisi per dosaggio di RLO, piruvati, lattati, glicerolo, glucosio e fattori di crescita per 24 ore (12 ratti) e 73 ore (12 ratti). Successivo sacrificio degli animali con prelievo del fegato rigenerato per misurazione quantitativa della rigenerazione.
Gruppo E: (N=24) laparotomia mediana, mobilizzazione del fegato, posizionamento di sonda da microdialisi a livello del lobo mediano destro e del lobo laterale destro. Ischemia ilare selettiva continua per 10 minuti a livello del peduncolo vascolare del lobo mediano e laterale sinistro. Rimozione della sonda a livello del lobo mediano destro e, quindi, epatectomia del 70%. Risveglio degli animali e prelievo del liquido interstiziale mediante microdialisi per dosaggio di RLO, piruvati, lattati, glicerolo, glucosio e fattori di crescita per 24 ore (12 ratti) e 73 ore (12 ratti). Successivo sacrificio degli animali con prelievo del fegato rigenerato per misurazione quantitativa della rigenerazione.
Gruppo F: (N=24) laparotomia mediana, mobilizzazione del fegato, posizionamento di sonda da microdialisi a livello del lobo mediano destro e del lobo laterale destro. Ischemia ilare selettiva intermittente di 5', riperfusione di 5' per 3 volte per un totale di minuti 15' durante la quale verranno dosati RLO, piruvati, lattati, glicerolo, glucosio e fattori di crescita a livello del liquido interstiziale a livello del peduncolo vascolare del lobo mediano e laterale sinistro. Rimozione della sonda a livello del lobo mediano destro e, quindi, epatectomia del 70%. Risveglio degli animali e prelievo del liquido interstiziale mediante microdialisi per dosaggio di RLO, piruvati, lattati, glicerolo, glucosio e fattori di crescita per 24 ore (12 ratti) e 73 ore (12 ratti). Successivo sacrificio degli animali con prelievo del fegato rigenerato per misurazione quantitativa della rigenerazione.
Tecnica del clampaggio ilare e della epatectomia.
In anestesia generale ottenuta con Ketamina veterinaria intraperitoneale mediante incisione mediana laparotomica si accede alla cavita' peritoneale.
Il clampaggio ilare viene eseguito con clamp microchirurgico posizionato per i tempi e con modalità descritti nei vari gruppi.
L'epatectomia nel ratto viene eseguita secondo la tecnica di Higgins e Anderson.
Una volta aperto il peritoneo si procede alla sezione del legamento falciforme; con una delicata pressione sul torace e sull'addome, i lobi mediano e sinistro tendono a protudere e ad esteriorizzarsi attraverso l'incisione. Si pone intorno ai due lobi un filo intrecciato 4/0 abbassato per quanto possibile verso la vena cava, quindi viene legato « en bloc» il peduncolo portale con le vene sovraepatiche.
Questa epatectomia equivale ad una resezione del 70% del fegato.
Viene registrata la mortalità per ogni gruppo.
Valutazione della rigenerazione epatica:
-1) misurazione del peso del fegato rigenerato :
Il fegato viene pesato dopo exanguinatio. Per ridurre le possibili varianti dovute alle differenze del peso corporeo, l'incremento di peso nel fegato rigenerante è stato calcolato con l'equazione di Becker (10):
Aumento del peso del fegato= (W1/BW1 - Wt/BWt)/(Wt / BWt)
(W1= peso dei lobi residui dopo epatectomia (valore derivato dal gruppo controllo). Wt = peso dei lobi rigenerati; BW1= peso dell'animale al momento dell'operazione; BWt = peso dell'animale al momento del sacrificio).
2)Valutazione dell'indice mitotico nell'epatocita: viene determinato in sezioni di fegato incluso in paraffina e colorato con ematossilina eosina. L'indice mitotico viene espresso come percentuale degli epatociti in mitosi per il numero totale di epatociti in campo 30X.
3)Valutazione immunoistochimica del «labeling index» dell'espressione del Ki67 a livello cellulare diretto indicatore delle cellule in fase di rigenerazione
