RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

METABOLISMO LOCALE ED ESPRESSIONE GENICA: NUOVE PROSPETTIVE IN CHIRURGIA

Università di riferimento

Università degli Studi INSUBRIA Varese-Como - SCIENZE CHIRURGICHE - VARESE(VA)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Patrizio CASTELLI

Descrizione

INTRODUZIONE:
L'unità di ricerca ha come scopo l'impiego della microdialisi nel monitoraggio del metabolismo periferico durante rivascolarizzazione degli arti inferiori con ischemia critica. In questo contesto, lo scopo secondario del presente studio sarà quello di indagare il metabolismo leucocitario ed endoteliale (con particolare riguardo ai parametri direttamente correlati alla regolazione del processo infiammatorio e della ATH, e al ruolo in questo processo dell'Ang II) nei soggetti sottoposti a trattamento chirurgico per la rivascolarizzazione periferica.
I pazienti selezionati per la rivascolarizzazioen chirurgica o endovasale saranno sottoposti al posizionamento di catetere da microdialisi a livello degli arti inferiori.
Tale procedura sarà eseguita solo dopo aver ottenuto un consenso scritto dal paziente approvato dal comitato etico dell'azienda ospedaliera.
I pazienti che presentino lesioni ischemiche estese o linfangite acuta in atto verranno esclusi dallo studio.
La variabilità interindividuale del metabolismo tissutale periferico, l'impossibilità di avere dei dati di normalità della concentrazioni dei metaboliti costringe alla valutazione di una zona ischemica e di una zona di controllo che nella maggioranza dei casi sarà rappresentato dall'arto controlaterale se non soggetto anche questo ad ischemia critica o il tessuto sottocutaneo addominale.

MATERIALI E METODI :

Lo studio prevede l'arruolamento di non meno di 60 pazienti affetti da ischemia critica dell'arto inferiore che presentino una sintomatologia caratterizzata da dolore a riposo e una claudicatio intermittens con intervallo libero < 50 m e/o lesioni trofiche periferiche . L'arruolamento non prevede limitazioni riguardanti sesso, età e precedenti interventi di chirurgia vascolare sull'arto interessato o tipo di anestesia (generale/locoregionale).
Il catetere da microdialisi verrà posizionato non meno di 12 ore prima dell'interevento chirurgico. La memrana viene infissa per via percutanea , in anestesia locale, a livello dell'avampiede dell'arto ischemico evitando aree di necrosi cutanea, il catetere di controllo verrà posizionato controlateralmente rispetto all'arto interessato. Tale metodica comporta uno stress per il paziente assolutamente trscuarbile con un rischio comparabile a quello di una iniezione sottocutanea.
I pazienti verranno sottoposti a rivascolarizzazione chirurgica a seconda delle indicazioni per ciascun caso bypass o TEA per lesioni interessanti il distretto femoro-popliteo o a rivascolarizzazione endovasale.

Il paziente verrà valutato secondo le classi sottoelencate. (tab 1 )


Pz
Età
Peso
DMNID/DMID
Stadio (III-IV)
Index ABPI pre
Index ABPI post
Durata clampaggio ( se chirurgico )
Mdc si/no
TEA/graft
Flusso a fem com ml/min preop/postop
Ph arterioso

Tab 1

La microdialisi viene effettuata dopo la rivascolarizzazione per 48/72 ore. Il flusso di infusione utilizzato è di 3 microL/min che permette un recovery di metaboliti prossimo al 100%.
Il catetere da microdialisi utilizzato è costituito da una membrana di poliammide di 30 mm di lunghezza ( CMA 60 Microdialysis Catheter ), collegato ad una pompa ad infusione variabile( CMA 106 Microdialysis Pump );il microdialisato è raccolto in vials da 200 micro/L per l'analisi effettuata tramite metodica enzimatica e colorimetrica ( CMA 600 Microdialysis Analyzer ).
I metaboliti esaminati sono glucosio, lattato, glicerolo e piruvato.
L'analisi statistica dei dati biologici periferici e della microdialisi verrà effettuata tramite il test di Dunnet e il test di Mann-Whitney.

La stretta dipendenza del metabolismo periferico dall'omeostasi generale dell'organismo, costringe ad un'attento monitoraggio dei parametri ematici. Il paziente verrà sottoposto al controllo degli esami ematici ( Tab 2 ) nei tempi previsti per la microdialisi.


Prelievi ematici

Preoperatorio

Gb,Gr,Hb,Hct, Plt, Ck, LDH, GOT, GPT, creatininemia, azotemia, e curva glicemica

intraoperatorio

Ph arterioso, glicemia

postoperatorio 24 h

Ph arterioso, glicemia, Ck, LDH, GPT, creatininemia , azotemia e curva glicemica


Tab 2.

Per quanto riguarda lo studio del metabolismo linfocitario ed endoteliale e dell'infiammazione sistemica i pazienti saranno studiati:
a) il giorno della decisione per l'intervento prima dell'inizio della terapia con statine;
b) il giorno dell'intervento;
c) dopo un follow up di 6 mesi.

Ad ogni valutazione, verrà effettuato un prelievo ematico di sangue venoso e verranno esaminati i seguenti parametri:
LEUCOCITI
Espressione di AT1-R su sottopopolazioni leucocitarie (valutazione dei livelli di mRNA tramite RT-PCR; valutazione citometrica dell'espressione dei recettori di membrana);
Livelli di eNOS in EC isolate da sangue venoso;
citochine: IL-8, TNF-alfa, IFN-gamma, TGF-beta e IL-10 (produzione nelle sottopopolazioni cellulari).
Le sottopopolazioni leucocitarie (granulociti, linfociti) isolate da campioni di sangue (vedi sotto) saranno messe in coltura in presenza di stimoli proinfiammatori (fMLP e LPS, usando protocolli standard usati nel nostro laboratorio) e la produzione di citochine sarà valutata sia prima che dopo attivazione funzionale delle cellule.

SIERO
citochine: IL-8, TNF-alfa, IFN-gamma, TGF-beta e IL-10
molecole di adesione: ICAM-1, VCAM-1, beta-integrina;
il siero sarà separato con metodiche standard di centrifugazione e i livelli sierici delle citochine saranno valutati con metodiche standard (ELISA, vedi sotto)
CELLULE ENDOTELIALI
Le cellule endoteliali saranno isolate con procedure di sorting immunomagnetico da sangue venoso (vedi sotto) e saranno studiati vari aspetti:
molecole di adesione: ICAM-1, VCAM-1, beta-integrina;
espressione dell'mRNA delle citochine menzionate.
Inoltre, il giorno dell'intervento chirurgico, la placca sarà prelevata, e le cellule endoteliali saranno isolate dalla placca per la valutazione dei seguenti parametri:
espressione di AT1-R;livelli di eNOS in EC; espressione dell'mRNA delle citochine e molecole di adesione sopra menzionate.


RISULTATI

La novità introdotta dalla microdialisi è la possibilità di monitoraggio diretto nel fluido interstiziale del metabolismo cellulare. L'ischemia critica è da sempre considerata una diagnosi clinica ma parametri indiretti di perfusione e vitalità tessutale sono valutati per la scelta del trattamento e la valutazione della prognosi. L'ischemia critica periferica è un quadro drammatico che in caso di fallimento della rivascolarizzazione conduce rapidamente ad amputazione maggiore con morbilità e mortalità elevate. Dati metabolici possono caratterizzare il quadro clinico della "CLI" seguire il processo della rivascolarizzazione evidenziando precocemente complicanze e l'utcome dell'intervento.

I fini di questo studio sono molteplici:

Valutare la microdialisi come indagine prognostica nelle rivascolarizzazioni periferiche.
- Evidenziare un markers prognostico positivo/negativo delle complicanze acute postoperatorie nelle rivascolarizzazioni periferiche.
- Studiare la sindrome da ischemia-rivascolarizzazione
- Indagare il metabolismo dei leucociti e delle cellule endoteliali (con particolare riguardo ai parametri direttamente correlati alla regolazione del processo infiammatorio e della ATH, e al ruolo in questo processo dell'Ang II) in pazienti affetti da CLI.