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UNITA' DI RICERCA
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Bibliografia
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Programma di ricerca
METABOLISMO LOCALE ED ESPRESSIONE GENICA: NUOVE PROSPETTIVE IN CHIRURGIAUniversità di riferimento
Università degli Studi INSUBRIA Varese-Como - SCIENZE CHIRURGICHE - VARESE(VA)Responsabile dell'Unità di ricerca
Giulio CARCANODescrizione
Compiti dell'unità operativa saranno:l'implementazione di uno studio sperimentale sugli effetti della preservazione del fegato con predeterminati livelli di danno ischemico
La valutazione della ripresa funzionale dell'organo in relazione ad un protocollo di induzione di tolleranza alloantigene specifica basata sulla somministrazione in monoterapia di ciclosporina ad alte dosi per un periodo limitato di tempo
La valutazione ex post della relazione tra danno ischemico, induzione di tolleranza e sopravvivenza del graft
Disegno sperimentale
Il modello sperimentale previsto è il trapianto ortotopico di fegato nel suino. Questo modello è ampiamente validato dalla letteratura internazionale per studi preclinici considerata l'analogia antomica e funzionale con l'uomo. Tale modello è implementato presso i laboratori di chirurgia sperimentale dell'università dELL'iNSUBRIA da molto tempo, con garanzie elevate di successo dello studio.
Gli animali saranno selezionati a coppie donatore ricevente con l'esecuzione preliminare di un coltura linfocitaria mista per escludere casi di compatibilità immunologica. Il peso previsto è 30-35 Kg. I donatori saranno tutti maschi ed i riceventi tutte femmine, allo scopo di consentire la ricerca delle cellule del donatore attraverso la cromatina sessuale. I preparati sperimentali verranno sacrificati dopo 90 giorni di osservazione
Gruppi
Gli animali saranno stratificati in gruppi come segue:
1. trapianto di fegato
2. trapianto di fegato e milza
3. trapianto di fegato e splenociti per iniezione portale
4. trapianto di fegato, con somministrazione di ciclosporina
5. trapianto di fegato e milza, con somministrazione di ciclosporina
6. trapianto di fegato e splenociti per iniezione portale, con somministrazione di ciclosporina
Induzione del danno da ischemia
I fegati prelevati al momento dell'espianto verranno randomizzati in tre differenti trattamenti:
a. reimpianto immediato nel ricevente
b. reimpianto del ricevente dopo 6 ore di preservazione
c. reimpianto nel ricevente dopo 12 ore di preservazione
Il tempo di preservazione verrà trascorso in sacchetto sterile parzialmente riempito di soluzione UW, mantenendo il fegato a temperatura stabile (ca. 4 centigradi) in ghiaccio d'acqua
Il disegno sperimentale previsto ripete il tipo di preservazione per ogni gruppo di studio previsto.
la numerosità prevista per il campione sperimentale sarà di 10 preparati (riceventi) per ogni gruppo
la numerosità del campione prevista è quindi in totale di 180 preparati
Anestesia
L'intervento chirurgico verrà condotto in condizioni di anestesia generale bilanciata sotto ventilazione meccanica ed in condizioni di asepsi
Tecnica chirurgica
Donatore
L'espianto di fegato avverrà dopo isolamento dell'organo, cannulamento di una arteria iliaca e della vena porta e perfusione con due litri di soluzione di conservazione (UW solution)
Preparazione su banco
Con tecnica su banco si procederà alla regolarizzazione dei capi vascolari, a colecistectomia e all'impianto dei biosensori
Foto 1: preparazione su banco (fase)
Ricevente
L'intervento prevederà l'espianto del fegato nativo dopo isolamento dell'organo. Il preparato verrà mantenuto in condizioni emodinamiche stabili con l'impiego di by-pass veno-venoso porto-cavo giugulare passivo. Tale sistema è routinariamente utilizzato presso il nostro laboratorio e garantisce l'equilibrio emodinamico per un tempo sufficiente alla rivascolarizzazione dell'organo trapiantato.
Il reimpianto avverrà con tecnica ortotopica del tutto simile a quella utilizzata clinicamente nell'uomo. I capi vascolari dell'organo donato verranno anastomizzati ai corrispondenti capi vascolari del ricevente, discontinuando il by pass al termine delle anastomosi
Foto 2: anastomosi vena cava inferiore sovraepatica (fase)
Foto 3: anastomosi vena cava inferiore sottoepatica (fase)
Foto 4: fegato rivascolarizzato
Trattamento immunosoppressivo
9 mg/Kg/giorno per 12 giorni con ciclosporina A in perfusione venosa centrale. Questo tipo di trattamento differisce profondamente dalle modalità di somministrazione cliniche. La dose proposta infatti non mira a controllare l'insorgenza del rigetto, ma a sopprimere la capacità del ricevente di montare una reazione di riconoscimento antigenica. In questo modo nel periodo di somministrazione è atteso lo sviluppo di tolleranza attraverso l'interazione tra cellule immunocompetenti del donatore e del ricevente. Dopo 12 giorni di trattamente la ciclosporina sarà sopspesa definitivamente
Tecnica microdialisi
La microdialisi verrà utilizzata impiantando cateteri di tipo a permanenza cronica nel fegato prima dell'espianto. Verranno eseguiti prelievi microdialitici secondo lo schema seguente:
1. basale, al termine dell'isolamento dell'organo
2. al momento del completamento del lavaggi dell'organo
3. su banco, ogni 20 min
4. al termine del tempo di conservazioneipotermica previsto
5. al momento dell'inizio delle procedure di reimpianto nel ricevente
6. in seguito ogni 20 minuti fino altermine dell'intervento chirurgico
7. giornalmente nel periodo di trattamento immunosoppressivo
8. ogni 3 giorni nel corso del primo mese postoperatorio
9. in seguito ogni 7 giorni fino al momento del sacrificio
I prelievi verranno analizati studiando glucosio, lattato, piruvato, glicerolo e il rapporto calcolato lattato/piruvato
Con lo stesso schema saranno inoltre eseguiti i normali tests biochimici di funzionalità epatica
Valutazione bioptica
Il fegato trapiantato verrà inoltre sottoposto a biopsie seriate per completare il monitoraggio dell'organo.
Valutazione della presenza della presenza di cellule del donatore.
La presenza di cellule del donatore verrà valutata periodicamente attraverso prelievi venosui periferici con il metodo PCR per la ricerca della cromatina maschile nei riceventi femmina. Dati positivi sono però attesi solo al momento del sacrificio del preparato, con il prelievo di sangue portale, midollo osseo, tessuto splenico trapiantato e tessuto epatico
I preparati sperimentali verranno mantenuti in condizione standard di stabulazione presso i laboratori di chirugia sperimentale dell'università dell'Insubria. Al compimento della novantesima giornata postoperatoria si procederà ad eutanasia, autopsia e valutazione finale istologica dell'organo trapiatato
