RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

METABOLISMO LOCALE ED ESPRESSIONE GENICA: NUOVE PROSPETTIVE IN CHIRURGIA

Università di riferimento

Università degli Studi INSUBRIA Varese-Como - MEDICINA CLINICA - VARESE(VA)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Achille VENCO

Descrizione

Il contributo del processo infiammatorio e del sistema renina-angiotensina al processo aterosclerotico sono stati esposti nella "Sezione 2.4". In particolare, abbiamo discusso il contributo della Ang II all'aterogenesi attraverso l'attivazione del AT1-R, e il reclutamento alla parete vasale attraverso un endotelio intatto, nella fase iniziale della ATH, di leucociti mononucleati, soprattutto monociti e cellule T. Quest'ultimo processo richiede l'attivazione dell'endotelio e porta all'espressione di molecole di adesione per i leucociti. In questo contesto, il contributo di diverse citochine e di specifiche molecole di adesione gioca un ruolo chiave nel sostenere il processo che porta all'ATH. Recentemente sono stati documentati sia il ruolo protettivo delle statine nella ATH che la loro efficacia nel ridurre non solo la progressione della placca ma anche gli effetti avversi legati alla endoarterectomia.

In questo contesto, lo scopo principale del presente studio sarà di quello di indagare il metabolismo dei leucociti e delle cellule endoteliali (con particolare riguardo ai parametri direttamente correlati alla regolazione del processo infiammatorio e della ATH, e al ruolo in questo processo dell'Ang II) in soggetti in lista d'attesa per un trattamento chirurgico per la rivascolarizzazione periferica. I pazienti arruolati saranno randomizzati in due gruppi:

#primo gruppo: almeno 20 paz trattati con 10 mg di atorvastatina;
#secondo gruppo: almeno 20 paz trattati con 80 mg di atorvastatina.

Un terzo gruppo di pazienti sottoposto a chirurgia d'urgenza e perciò senza trattamento con statine) sarà incluso nello studio come controllo (vedi sotto, Fasi dello studio).

La terapia farmacologica sarà continuata dopo il giorno dell'intervento (l'intervallo medio fra la decisione clinica e l'intervento nel nostro ospedale è di 30 giorni) e dopo, per ulteriori 6 mesi.

I pazienti saranno studiati:
a) il giorno della decisione per l'intervento prima dell'inizio della terapia con statine;
b) il giorno dell'intervento;
c) dopo un follow up di 6 mesi.

Ad ogni valutazione, verrà effettuato un prelievo ematico di sangue venoso e verranno esaminati i seguenti parametri:

LEUCOCITI
Espressione di AT1-R su sottopopolazioni leucocitarie (valutazione dei livelli di mRNA tramite RT-PCR; valutazione citometrica dell'espressione dei recettori di membrana);
Livelli di eNOS in EC isolate da sangue venoso;
citochine: IL-8, TNF-alfa, IFN-gamma, TGF-beta e IL-10 (produzione nelle sottopopolazioni cellulari).
Le sottopopolazioni leucocitarie (granulociti, linfociti) isolate da campioni di sangue (vedi sotto) saranno messe in coltura in presenza di stimoli proinfiammatori (fMLP e LPS, usando protocolli standard usati nel nostro laboratorio) e la produzione di citochine sarà valutata sia prima che dopo attivazione funzionale delle cellule.

SIERO
citochine: IL-8, TNF-alfa, IFN-gamma, TGF-beta e IL-10
molecole di adesione: ICAM-1, VCAM-1, beta-integrina;
il siero sarà separato con metodiche standard di centrifugazione e i livelli sierici delle citochine saranno valutati con metodiche standard (ELISA, vedi sotto)
CELLULE ENDOTELIALI
Le cellule endoteliali saranno isolate con procedure di sorting immunomagnetico da sangue venoso (vedi sotto) e saranno studiati vari aspetti:
molecole di adesione: ICAM-1, VCAM-1, beta-integrina;
espressione dell'mRNA delle citochine menzionate.

Inoltre, il giorno dell'intervento chirurgico, la placca sarà prelevata, e le cellule endoteliali saranno isolate dalla placca per la valutazione dei seguenti parametri:
espressione di AT1-R;
livelli di eNOS in EC;
espressione dell'mRNA delle citochine e molecole di adesione sopra menzionate.

FASI DELLO STUDIO
Lo studio verrà condotto in 2 fasi: durante la PRIMA FASE (durata: 6 mesi), i pazienti inclusi in questo studio saranno divisi in due gruppi come sopra descritto. Inoltre, sarà studiato un terzo gruppo di pazienti (pazienti senza trattamento con statina e che saranno sottoposti ad intervento d'urgenza). Durante questa fase dello studio, il primo obiettivo sarà quello di valutare, nei parametri menzionati, le potenziali differenze tra i gruppi trattati con basse e alte dosi di atorvastatina. Inoltre, valuteremo in EC isolate dalle placche se i parametri differiranno nei tre gruppi di pazienti.
Durante la SECONDA FASE (durata: 12 mesi), i due gruppi di pazienti trattati con atorvastatina durante il mese prima dell'intervento continueranno con la stessa dose di farmaco per un mese e dopo una valutazione clinica e di laboratorio, la dose sarà modificata se necessario, nel gruppo con basso dosaggio (gruppo 1) per raggiungere il target di trattamento dell'LDL (pazienti ad alto rischio: LDL sotto i 100 mg/dl) mentre i pazienti con atorvastatina 80 mg continueranno con la stessa terapia. I potenziali pazienti arruolati dopo intervento d'urgenza saranno seguiti come il Gruppo 1. Durante questa fase il primo obiettivo sarà quello di valutare quanti pazienti dei tre gruppi saranno risottoposti a chirurgia per ragioni cliniche durante i 6 mesi di follow up o mostreranno una progressione clinica della malattia periferica. Come secondo obiettivo analizzeremo gli stessi parametri coinvolti nell'aterogenesi investigata nella prima fase (sia da sangue che eventualmente dalle placche).

PAZIENTI
Arruoleremo pazienti inviati al nostro Centro per le dislipidemie dal chirurgo vascolare del nostro Ospedale, che saranno messi in lista per l'intervento chirurgico e/o per endoarterectomia per una vasculopatia periferica.
Come criteri di eclusione, verranno esclusi pazienti già in trattamento con statine, ACE inibitori, bloccanti del AT1-R, steroidi. Inoltre, non saranno inclusi in questo studio pazienti con elevate CK (2 volte il limite massimo normale), livelli di creatinina sierica  2.5 mg/dl; livelli di ALT, AST di due volte il limite massimo. Il protocollo sarà sottoposto all'approvazione del Comitato Etico locale e sarà richiesto ai pazienti il consenso informato.

I pazienti saranno valutati:
1) al momento di indicazione all'intervento;
2) il giorno dell'intervento;
3) durante il follow up: 1 mese dopo l'intervento, ogni 2 mesi se l'esame clinico non indica variazioni;
4) dopo 6 mesi dall'intervento.

Una valutazione clinica con esami di laboratorio standard sarà fatta ad ogni valutazione, mentre alla valutazione 1, 2 e 4 sarà effettuato anche un prelievo ematico come sopra descritto. Alla valutazione 2 saranno analizzati anche i parametri dalla placca.

I pazienti saranno istruiti a non assumere altri farmaci durante lo studio o, nel caso, se necessario, ad informarne il nostro centro.

I parametri clinici esaminati ad ogni valutazione includeranno:
1) pressione del sangue (mmHg);
2) frequenza cardiaca (bpm);
3) indice caviglia-braccio –ABI-;
4) peso corporeo (Kg);
5) altezza (cm);
6) indice di massa corporea (Kg/cm2);
7) circonferenza vita (cm).

Esami di routine bio-umorali ad ogni valutazione: Colesterolo tot, colesterolo HDL, trigliceridi, Lp(a). Apoproteina A, Apoproteina B, ALT, AST, GGT, ALP, CK. Inoltre, alle valutazioni 1, 2 e 4: creatinina, fibrinogeno, proteina C reattiva (PCR) ad alta sensibilità, glicemia e insulinemia basali, TSH, omocisteina, uricemia, microalbuminuria, frazione LDL (calcolata secondo la formula: LDL=colesterolo totale-(1/5 trigliceridi+HDL)), indici di insulino-resistenza (calcolati come glucosio basale/insulina basale), indice HOMA-IR, calcolato come: [insulina basale (pmol) x glucosio basale (mmol/l)/22.5]. inoltre, alla valutazione 2: elettroforesi proteica, emocromo, PT, INR, aPTT, sodio, calcio, potassio, urea, LDH, bilirubina, colinesterasi, ferritina, amilasi, esami delle urine.

* Preparazione e messa in coltura delle cellule
Le cellule saranno isolate da sangue periferico (provetta eparinata) prelevato da pazienti e lasciato sedimentare in destano a 37°C per 30 min, quindi il surnatante sarà recuperato e le PBMCs e i PMNs verranno separati con metodiche standard. Le tipiche sospensioni di PBMC contengono circa il 16% di monociti e l'80% di linfociti. Con questa metodica, i PMNs ottenuti risultano puri al 95%; e sono evidenziabili inquinamenti da eritrociti o piastrine né alla microscopia ottica né all'analisi citofluorimetrica. I monociti saranno purificati con metodiche di sorting immunomagnetico come desritto in seguito. In alcuni esperimenti le cellule saranno messe in coltura alla concentrazione di 1 milione cell/ml in terreno di coltura RPMI 1640 modificato a 37°C, in atmosfera controllata (5% CO2). Alla fine del periodo di incubazione (differente a secondo del protocollo sperimentale), le cellule saranno raccolte per le analisi successive.

* Isolamento delle cellule endoteliali da pezzi operatori e da sangue venoso
I campioni di porzioni di vasi venosi ottenuti dall'intervento di resezione chirurgica a cui saranno sottoposti i pazienti saranno posti in PBS contenente streptomicina solfato (10.000 microg/ml) e penicillina (10.000 U/ml) e tenuti alla temperatura di 4°C. I tessuti saranno poi sezionati in frammenti di circa 5 mm cubici. Quindi i frammenti verranno posti in PBS a cui è stato aggiunto lo 0.25% di collagenasi di tipo II ed incubati a 37°C per 30-60 min in agitazione. Successivamente, il tessuto digerito sarà lavato per due volte in PBS e filtrato attraverso pori del diametro di 70 micron. Le cellule endoteliali (EC) vengono poi isolate dalla sospensione cellulare ottenuta mediante il kit Dynabeads CD31 Endothelial Cell (Dynal Biotech).

* Determinazione della produzione di citochine e di molecole di adesione
L'analisi quantitativa di TGF-beta, IL-8 e TNF-alfa nel surnatante di cellule messe in coltura, siero e plasma e la forma solubile ICAM-1, VCAM-1 e beta-integrina nel surnatante di EC in coltura sarà determinata mediante un'analisi quantitativa che si avvale di un test immunoenzimatico mediante l'utilizzo di un kit ELISA secondo il protocollo fornito dalla ditta produttrice.

* Saggio per la valutazione dell'espressione della proteina eNOS.
Le EC ottenute dalla placca o da sangue periferico saranno incubate con il reagente M-PER (150 microl/3x10 milioni di cellule) e con inibitori delle proteasi (1:50) in ghiaccio per 15 min. Quindi i campioni saranno centrifugati a 13000 rpm per 20 min a 4°C. I surnatanti vengono recuperati ed il loro contenuto proteico sarà dosato con il metodo Breadford. L'espressione della proteina eNOS verrà valutata mediante la tecnica di Western Blot.

* Purificazione di PBMCs e PMNs per analisi in RT-PCR
Dopo la procedura di separazione precedentemente descritta, dalle preparazioni di PBMCs verranno isolate delle sottopopolazioni altamente purificate CD2+ (linfociti T) e CD14+ (monociti) mediante un procedimento di cell-sorting immunomagnetico. La conta cellulare sarà effettuata con una camera burker per verificare il numero e la purezza del preparato, che verificata dal'analisi citfluorimetrica è del 98-99%. La vitalità cellulare, verificata per mezzo del trypan blu exclusion test, è del 95-98%.

* Isolamento di RNA e analisi in RT-PCR dell'mRNA di AT1-R, citochine e di molecole di adesione
L'isolamento di RNA e l'analisi in RT-PCR dell'mRNA sarà eseguito con procedure standards. Brevemente, l'RNA totale sarà stato estratto da ciascuna sottopopolazione cellulare (1milione cell) utilizzando il kit Perfect RNA Eukaryotic Mini kit (Eppendorf, Hamburg, Germany) e la quantità sarà stimata mediante spettrofotometria a 260 nm. L'RNA totale sarà poi retrotrascritto e il cDNA sarà amplificato mediante il kit di reazione "one-step RT-PCR" (Finnzymes, Espoo, Finland). La reazione di PCR sarà eseguita utilizzando un termociclatore. La quantificazione sarà ricavata mediante l'analisi densitometrica (tramite software) dei negativi fotografici del gel di agarosio (Multi-Analyst, BioRad). Per la selezione dei primers, ci siamo riferiti al database del National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Infine i dati saranno espressi come rapporto di densità ottica (O.D.) tra l'mRNA della sostanza in esame e l'mRNA dello standard scelto.

* Immuno-marcatura del recettore AT1 in sottopopolazioni leucocitarie
Aliquote da 100 microl di sangue intero, ottenute come descritto sopra, saranno incubate con 10 microl di anticorpo anti AT1 (n-10) (1:20 per i linfociti e 1:10 per monociti e granulociti) per 20 min a 4°C; successivamente sono state lavate in PBS e centrifugate a 1400 x g per 5 min a 20°C. I surnatanti saranno eliminati e i pellets saranno incubati con 10 microl di anticorpo secondario FITC-GAR (1:80) per 20 min a 4°C al buio. In ogni sessione di analisi, i campioni della stessa specie saranno marcati col solo anticorpo secondario (controllo negativo) per stimare il livello al di sopra del quale la fluorescenza si possa considerare specifica.
Dopo questo periodo di incubazione, i campioni sono stati lavati una volta, e le cellule sono state marcate con gli anticorpi specifici per definire ciascuna sottopopolazione leucocitaria. In particolare, sono stati utilizzati 5 microl di anti CD45-PE e 5 microl di anti CD16-TC o CD14-APC per identificare rispettivamente i PMNs ed i monociti. I linfociti T saranno marcati con 5 microl di anti CD45-PE e 5 microl di anti CD3-TC. I campioni saranno poi incubati per 15 min a temperatura ambiente e al buio. Dopo la lisi degli eritrociti mediante 2 ml di soluzione ipotonica, le cellule saranno lavate per due volte e risospese in 0.5 ml di PBS per l'analisi citofluorimetrica.

* Immuno-marcatura del recettore AT1 nelle EC
EC (1 milione cellule/ml) saranno incubate con 10 microl di anticorpo anti AT1 (n-10) per 20 min a 4°C; successivamente sono state lavate in PBS e centrifugate a 300 x g per 5 min a 20°C. Il surnatante sarà eliminato ed il pellet verrà incubato con 10 microl di anticorpo secondario FITC-GAR (1:80) per 20 min a 4°C al buio. In ogni passaggio dell'analisi, i campioni saranno marcati con il solo anticorpo secondario (controllo negativo) per stimare il livello al di sopra del quale la fluorescenza si possa considerare specifica.
Dopo l'incubazione, i campioni saranno sottoposti a lavaggio e risospesi in 0.5 ml di PBS per l'analisi citofluorimetrica.

* Analisi citofluorimetrica
L'analisi citofluorimetrica dell'espressione del recettore AT1 sarà effettuata mediante un citofluorimetro EPICS Elite ESP equipaggiato con un laser ad argon a 15 mW raffreddato ad aria con emissione ad una lunghezza d'onda di 488 nm per l'eccitazione di FITC, PE, e TC e per i segnali morfologici di rifrazione della luce [forward scatters (FSC) e side scatters (SSC)]. Il citometro è equipaggiato inoltre con un laser a elio-neon (10-mW) con emissione ad una lunghezza d'onda di 633 nm per permettere l'eccitazione di APC. La fluorescenza verde della FITC e la fluorescenza arancione della PE saranno raccolte rispettivamente dal PMT2 (tubo fotomoltilplicatore) attraverso un filtro passa-banda a 525 nm e dal PMT3 con un filtro a 575 nm. La fluorescenza rossa di TC e APC sarà raccolta da PMT5 attraverso un filtro 675 BP. I segnali di fluorescenza verranno raccolti su una scala a quattro decadi logaritmiche. Per ogni campione saranno analizzati un minimo di 50.000 eventi. La fluorescenza cellulare sarà quantificata utilizzando sia la percentuale di eventi positivi, che il canale dell'intensità media di fluorescenza (MFI), ovvero il valore medio della distribuzione dell'intensità di fluorescenza. I risultati saranno espressi in percentuale di cellule positive (%) e in valore di intensità media di fluorescenza normalizzata (NMFI), che sarà la percentuale di cellule positive moltiplicata per i corrispondenti valori di MFI.