RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

STUDI SUI FATTORI GENETICI ED IMMUNOLOGICI CHE REGOLANO IL DANNO TESSUTALE ED IL DECORSO CLINICO DELL'ARTRITE REUMATOIDE

Università di riferimento

Università degli Studi del PIEMONTE ORIENTALE "Amedeo Avogadro"-Vercelli - SCIENZE MEDICHE - VERCELLI(VC)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Sandra D'ALFONSO

Descrizione

Questo progetto ha due obiettivi:
1) Lo scopo principale è l'identificazione di geni coinvolti nelle diverse manifestazioni cliniche (compresa la risposta alla terapia) e immunologiche dell'AR. A questo scopo i pazienti AR verranno tipizzati per diverse variazioni di sequenze nucleotidiche nei geni sottoelencati. La frequenza delle variazioni di sequenza saranno confrontate in pazienti AR suddivisi sulla base dei diversi fenotipi clinici e immunologici descritti nei progetti delle Unita' cliniche e caratterizzate dai centri clinici che partecipano a questo progetto.
2) Inoltre verrà analizzata l'associazione dei polimorfismi selezionati con la suscettibilità all'AR che finora non è mai stata analizzata nella popolazione Italiana. Sarà eseguito uno studio di associazione caso-controllo
Per entrambi gli obiettivi il coinvolgimento di ciascuna variazione genetica verrà analizzata separatamente e in combinazione con le altre variabili genetiche e fenotipiche con lo scopo di verificare le interazioni dei diversi fattori. Dal momento che verranno eseguiti molti confronti, i risultati significativi saranno confermati in un secondo gruppo indipendente di pazienti AR per evitare di applicare la correzione di Bonferroni per i confronti multipli. I tre centri clinici che partecipano a questo studio seguono una casistica totale di almeno 500 pazienti AR le cui caratteristiche cliniche e immunologiche sono state raccolte per un periodo di almeno due anni. La raccolta del DNA di un primo gruppo di 300 pazienti è già iniziata e sarà completata nei primi 6-8 mesi del progetto mentre la raccolta di un secondo gruppo di 200 pazienti per la replicazione dei risultati significativi sarà completata entro la fine del primo anno del progetto. Il DNA di 300 controlli è già disponibile e si sta raccogliendo un campione di controlli (almeno 200) per la replicazione dei dati significativi.
Verranno analizzate variazioni di sequenza nei seguenti geni:
a) HLA. Tutti i pazienti saranno tipizzati per gli alleli HLA-DRB1, HLA-DQB1 e HLA-DQA1 con lo scopo di analizzare il coinvolgimento dell'epitopo condiviso (SE, shared epitope) e degli alleli DQ, in linea con quanto riportato nelle altre popolazioni. Pochi dati sono stati riportati per la popolazione italiana: un lavoro recente ha confermato in Italia il coinvolgimento degli alleli DRB1 nella suscettibilità ad AR in 264 pazienti (Bongi 2004) e un lavoro precedente in un piccolo gruppo di 86 pazienti aveva riportato un'associazione degli alleli HLA-DRB1*04 con la gravità della malattia definita sulla base dei danni radiografici (Salvarani 1998).
Inoltre i genotipi HLA saranno utilizzati per stratificare tutti gli altri fattori genetici e non genetici

b) PTPN22 (1p13). In questo gene il ruolo della variazione missense R620W nella suscettibilità ad AR è stato chiaramente dimostrato in almeno quattro popolazioni. Finora non sono stati riportati dati nella popolazione italiana. Inoltre, a parte uno studio recente che dimostra che l'allele R620W è associato con la positività per fattore reumatoide (Lee 2005), il coinvolgimento di questa variazione nelle manifestazioni cliniche e immunologiche della AR non è stato ancora valutato.
c) Geni PAD. Analizzeremo l'associazione di geni coinvolti nel meccanismo della citrullinazione. Questo meccanismo post-traduzionale è catalizzato da una famiglia di enzimi calcio-dipendenti, peptidilarginina deiminasi (PAD). Sono noti cinque membri di enzimi PAD (PAD1, PAD2, PAD3, PAD4, PAD6). Mappano in una regione di circa 330 Kb sul cromosoma 1p36, una regione in linkage con AR secondo quanto riportato da diversi screening genomici. Studi di associazione hanno evidenziato una forte associazione con polimorfismi del gene PAD4 nella popolazione giapponese, non confermati in due popolazioni europee. Come riportato per altre malattie genetiche, questi risultati contrastanti potrebbe dipendere dalla diversa frequenza e/o diverse combinazioni aplotipiche delle variazioni di sequenza nel gene PAD4 nella popolazione giapponese ed europea. Pertanto, ricercheremo direttamente nei pazienti Italiani variazioni nucleotidiche nel gene PAD4 che poi utilizzeremo per gli studi di associazione. Inoltre analizzeremo variazioni di sequenza anche nel gene PAD2, l'altro gene PAD che è espresso nel liquido sinoviale, principalmente da parte dei macrofagi, e quindi è potenzialmente implicato nella suscettibilità e severità della AR. A parte una modesta associazione di SNP in PAD2 con AR (che non reggeva la correzione per il numero di confronti) nell'originale studio giapponese, nessuno degli altri studi ha analizzato il coinvolgimento di PAD2 sia nella suscettibilità che nel decorso clinico della AR. Le variazioni di sequenza verranno cercate sequenziando gli esoni (16 per entrambi i geni), le giunzioni esone/introne, il promotore e le regioni del 3'UTR di PAD4 e PAD2 in 30 pazienti AR. Le sequenze identificate saranno analizzate preliminarmente in un pannello di 70 pazienti allo scopo di calcolare la frequenza genica, il linkage disequilibrium e le frequenze aplotipiche. Tra i polimorfismi identificati saranno selezionati per lo studio di associazione solo quelli con una frequenza genica >5%, includendo preferenzialmente i marcatori di blocchi aplotipici e gli SNP potenzialmente rilevanti da un punto di vista funzionale (nelle sequenze codificanti o regolative).
d) Osteopontina OPN (4q21-25). Analizzeremo due SNP, nella regione 5' flanking e nel 3'UTR del gene, rispettivamente, per i quali abbiamo recentemente riportato un'associazione con la suscettibilità al LES, con l'espressione clinica del LES e con una produzione aumentata della proteina nel siero. Due studi non hanno riportato associazione tra AR e polimorfismi nella regione 3' di OPN nella popolazione cinese e spagnola (Xu; Urcelay; 2005). Tuttavia non hanno analizzato l'associazione con le diverse manifestazioni della malattia e non hanno testato SNP della regione al 5' di OPN. Nessun dato di associazione AR-OPN e' stato riportato per la popolazione italiana. E' interessante notare che nella popolazione italiana il coinvolgimento di OPN è stato chiaramente dimostrato in altre due malattie autoimmuni oltre al LES, MS (Chiocchetti in press) e la rara sindrome autoimmune linfoproliferativa (Chiocchetti 2004), ad indicare che in questa popolazione OPN gioca un ruolo molto importante per lo sviluppo di diverse condizioni autoimmuni. Per i pazienti RA arruolati per questo studio sono stati raccolti dalle altre unità un gran numero di campioni di siero e liquido sinoviale, a diversi tempi di malattia e dall'inizio del trattamento farmacologico. Questa Unità misurerà l'espressione proteica di OPN con ELISA in un primo gruppo rappresentativo di campioni allo scopo di correlare l'espressione di OPN con le diverse manifestazioni cliniche e la risposta alla terapia. Inoltre verrà anche analizzata la correlazione tra i livelli di OPN e i genotipi OPN.
e) CASP3 (4q34) e CASP8 (2q33-34). Verranno inoltre inclusi nel nostro studio i geni che codificano per caspasi 3 (CASP3) e caspasi 8 (CASP8) per fornire una base genetica alle analisi immunopatologiche e cliniche condotte dall'Unità di Padova. Sequenzieremo il promotore prossimale e le regioni 3'UTR di entrambi i geni nei pazienti caratterizzati per produzione di caspasi 3 e caspasi 8 dall'Unità di Padova. Le variazioni di sequenza identificate ed altre selezionate dai database degli SNP saranno analizzate per testare l'associazione con AR (in pazienti e controlli) e con le manifestaziono cliniche e immunologiche di AR (in sottogruppi di pazienti)

Fasi:
1)Raccolta di campioni di DNA di circa 300 pazienti RA da parte dei 3 centri clinici inclusi in questo progetti. Il DNA verrà purificato da questa Unità. Tutti i pazienti saranno caratterizzati per caratteristiche cliniche e immunologiche. Il DNA di un gruppo di 300 controlli paragonabili per eta' sesso e provenienza regionale è già disponibile. Considerando un power (beta) di 0.8 e una significatività statistica (alpha) di 0.05 lo studio caso-controllo permetterà di evidenziare associazioni che conferiscono un rischio (OR) compreso tra 1.6 e 2.0 per una frequenza dell'allele associato compreso tra 0.5 e 0.1.
2) ricerca di variazioni nei geni PAD4 e PAD2 con DHPLC (denaturing high performance liquid chromatography) nei 16 esoni, giunzioni introne/esone, 5'UTR e 1000bp della regione 5'flanking, 3'UTR (245bp per PAD4 2282bp per PAD2) in 30 pazienti AR caratterizzati per specifiche caratteristiche immunopatologiche. Ricerca di variazioni di sequenza nel promotore prossimale (circa 1000 bp) e del 3' UTR di CASP3 (1575bp) e CASP8 (305bp). Le variazioni identificate saranno confermate con il sequenziamento diretto.
3) Genotipizzazione dei pazienti e controlli per i polimorfismi selezionati più quelli identificati nel punto precedente. Oltre la variazione R620W nel gene PTPN22 e i due SNP in OPN nella regione 5' flanking (-156) e 3'UTR (+1239) stimiamo di analizzare circa 10 SNPs per ciascuno dei due geni PAD e dei due geni delle caspasi. La genotipizzazione verrà condotta con il metodo SNaPshot che permette di analizzare al sequenziatore capillare automatico fino a 8 SNP nella stessa reazione. La tipizzazione HLA verra' condotta con metodi standard. I controlli sono già stati tipizzati con gli stessi metodi per gli alleli DRB1, DQB1 e DQA1.
4) Analisi statistica per valutare l'associazione con la suscettibilità alla AR (confronto pazienti/controlli) e con specifiche caratteristiche cliniche, immunologiche e di risposta alla terapia (confronto tra i sottogruppi di pazienti). L'analisi sarà condotta per ciascun SNP e per combinazioni di SNP localizzati nello stesso o in differenti geni e dopo stratificazione per alleli HLA. L'associazione della suscettibilità a AR e della sua espressione clinica con genotipi e combinazioni aplotipiche sarà anche analizzata.
5) I risultati significativi saranno confermati su un secondo pannello di 200 pazienti e 200 controlli la cui raccolta è stata avviata e sarà completata entro la fine del primo anno del progetto. Questo approccio non renderà necessaria la correzione di Bonferroni nell'analisi statistica.
6) L'espressione di osteopontina sarà inizialmente misurata nel siero e nel liquido sinoviale di un piccolo gruppo di pazienti rapresentativi delle diverse manifestazioni cliniche di AR e risposta al trattamento farmacologico. I risultati interessanti saranno confermati in tutti i campioni disponibili

MATERIALI E METODI
1) Il DNA verrà purificato con il metodo del salting out.
2) L'analisi DHPLC è eseguita su uno strumento HPLC automatizzato dotato di una colonna specifica per l'analisi di frammenti di DNA (Wave, Transgenomic Santa Clara, California). Il metodo si basa sulla ritenzione differenziale delle molecole di DNA omoduplici ed eteroduplici in condizioni di parziale denaturazione al calore. Le molecole di DNA eteroduplici si formano solo quando nel frammento di DNA esaminato è presente una variazione allo stato eterozigote. Per permettere la formazione di molecole eteroduplici i prodotti di PCR sono denaturati per 3min a 95°C seguita da graduale reibridazione da 95°C a 40°C in 30min in un termociclatore. La temperatura richiesta per una buona risoluzione delle molecole eteroduplici può essere predetta con un algoritmo specifico (http://insertion.stanford.edu/melt.html). I campioni sono analizzati alla temperatura predetta (RTm) e a RTm +2°C e eluiti dalla colonna con un gradiente lineare di acetonitrile con un flusso di 0,9ml/min
3) SEQUENZIAMENTO. I campioni sono sequenziati in entrambe le direzioni sul sequenziatore automatico Applied Biosystems (ABI) 3100 con il kit di reazione Big-dye terminator cycle sequencing (ABI).
4) Il metodo SNaPshot si basa su una reazione di primer extension. Il primer utilizzato che termina alla base immediatamente al 5'della variazione di sequenza, è esteso con ddNTPs fluorescenti e analizzato sul sequenziatore ABI 3100. Con un disegno attento di primer di diversa lunghezza è possibile analizzare fino a 8 SNP in una singola reazione di primer extension . Gli elettroferogrammi che ne derivano saranno analizzati con il programma ABI GENESCAN (versione 3.7).
5) La tipizzazione HLA-DRB1 sarà condotta con il kit a bassa risoluzione PCR-SSP kit (Dynal). Per i gruppi rilevanti di alleli DRB1, la presenza dello SE o della sequenza protettiva DERAA sarà rilevata per mezzo del sequenziamento diretto dei prodotti di PCR derivanti dalla tipizazione a bassa risoluzione con il kit PCR-SSP. Gli alleli DRB1 e DQA1 saranno tipizzati con il metodo PCR-SSO messo a punto durante l'XI Workshop di Istocompatibilità (Kimura and Sasazuki, 1991).
6) La concentrazione di OPN nel siero verrà misurata con tecnica ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) seguendo il protocollo proposto dal fornitore (Calbiochem, San Diego, CA). Le unità di densità ottica saranno misurate ad un'assorbanza di 450nm utilizzando un lettore di micropiastre (Bio-Rad, Hercules, CA) e la curva di regressione verrà calcolata sulla base di una curva di riferimento con il programma I-smart.
7) ANALISI STATISTICA. La significatività è valutata da tavole di contingenza con il test del chi quadrato (con la correzione di Yates) o con test esatto di Fisher a due code. L'associazione di ciascun polimorfismo con la malattia è misurata calcolando gli Odds Ratio e gli intervalli di confidenza al 95% con il metodo di Woolf. Il linkage disequilibrium e le frequenze aplotipiche da dati con fase gametica incerta saranno calcolate con l'algoritmo Expectation-Maximization (EM) algorithm (Arlequin ver2.0, 22). L'effetto congiunto dei diversi polimorfismi è testato con un'analisi di regressione logistica multivariata. Le interazioni di diversi SNPs localizzati nello stesso gene o in geni diversi verrà valutata con il "combination test" (Jannot 2003).