RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

STUDI SUI FATTORI GENETICI ED IMMUNOLOGICI CHE REGOLANO IL DANNO TESSUTALE ED IL DECORSO CLINICO DELL'ARTRITE REUMATOIDE

Università di riferimento

Università degli Studi di PADOVA - SCIENZE MEDICHE E CHIRURGICHE - PADOVA(PD)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Ugo FIOCCO

Descrizione

Il progetto si articolerà in due parti:
1) Apoptosi e citrullinazione proteica. Questa parte riguarderà più direttamente la nostra Unità per lo svolgimento del programma di ricerca descritto in questo Modello B.
2) Raccolta dei dati e dei campioni biologici per la realizzazione del progetto generale. In questa parte del progetto il compito della nostra Unità di Ricerca sarà quello di raccogliere i dati ed i campioni biologici dei pazienti con AR da noi seguiti secondo le indicazioni ed i criteri descritti nel Modello A.

Apoptosi e citrullinazione proteica
Recentemente, è stato condotto uno studio riguardante l'espressione e l'attività degli enzimi PAD in monociti e macrofagi del sangue periferico (PBMCs) e del liquido sinoviale di pazienti affetti da AR (Vossenaar ER 2004), ma non è stata indagata la correlazione tra espressione degli enzimi PAD e Caspasi, anche in relazione all'induzione degli anticorpi anti-CCP durante la morte cellulare per apoptosi.
Pertanto, lo scopo della prima parte del nostro studio è quello di studiare a livello proteico e di RNAm, l'espressione degli enzimi PAD in correlazione all'espressione di enzimi specifici di morte cellulare, le Caspasi, e all'induzione degli anti-CCP.
Saranno reclutati 20 pazienti affetti da AR secondo i criteri ACR per la classificazione dell'AR (Arnett FC, 1998) possibilmente in fase iniziale di malattia e senza terapia, 20 affetti da sinoviti croniche e 20 soggetti sani come gruppo di controllo.
I pazienti verranno regolarmente seguiti per un anno con controlli quadrimestrali. Ad ogni controllo verranno eseguite valutazione clinica, bioumurale e sieroimmunologica completa e misurazione dell'attività di malattia, come indicato nel modello A.
In particolare, per ciascun individuo saranno raccolte le seguenti informazioni generali: sesso, razza, epoca di comparsa dei primi sintomi, data della diagnosi, età al momento della diagnosi. Saranno poi considerati per ogni paziente i dati anamnestici, clinici e di laboratorio che supportano la diagnosi di AR.
Ad ogni controllo verrà registrata la terapia e verranno effettuati tre prelievi di sangue intero in EDTA, ciascuno da 10 mls. Un prelievo verrà utilizzato per l'isolamento dei linfociti e gli altri due inviati all'Unità Coordinatrice ed all'Unità di Novara per la purificazione del DNA necessario allo svolgimento delle indagini immunogenetiche previste dai ripettivi modelli B. Campioni di siero di ciascun paziente verranno raccolti agli intervalli regolari nel corso del follow-up. Quando possibile, verrà prelevato liquido sinoviale dalle articolazioni interessate dal processo immunoflogistico.
I linfociti saranno isolati in sterilità mediante stratificazione su gradiente di Ficoll, lavati e contati in camera di Burker mediante colorazione vitale con Eosina. Una piccola aliquota di almeno trecento cellule verrà colorata con il colorante DAPI ed osservata al microscopio a fluorescenza per evidenziare cellule morfologicamente apoptotiche ed un'altra aliquota con il Tripan Blue allo scopo di evidenziare attraverso l'osservazione al microscopio ottico cellule morfologicamente necrotiche.
I linfociti ed i campioni di siero di ciascun paziente e dei soggetti sani divisi in aliquote saranno in parte conservate a –80°C fino al momento dell'uso ed in parte spedite alle altre Unità Operative (UO) partecipanti al progetto per lo svolgimento delle analisi previste nei rispettivi modelli B. Un'aliquota di PBMCs verrà utilizzata subito per l'estrazione dell'RNA.
Per ciascun paziente verrà caratterizzato il profilo anticorpale specifico per la diagnosi di AR mediante le seguenti metodiche:
- ELISA per la determinazione degli anti-CCP
- Nefelometria per la determinazione del FR (IgM e IgG)
Dai linfociti dei pazienti e dei soggetti sani sarà isolato a fresco l'RNA mediante estrazione con il kit RNAzol B (Biotex, Houston, TX, U.S.A.) seguendo le istruzioni della ditta manifattrice. L'RNA totale estratto verrà utilizzato come "stampo" per sintetizzare il cDNA corrispondente. Il cDNA verrà retrotrascritto ed amplificato mediante RT-PCR semiquantitativa utilzzando primer specifici per le Caspasi 8 e 3, e per gli enzimi PAD2 e PAD4. Come controllo interno verrà utilizzato il gene "housekeeping" codificante per la subunità ribosomiale maggiore 18S. Allo scopo di quantificare l'espressione dell'RNA messaggero (RNAm) specifico per le Caspasi 8 e 3, e per gli enzimi PAD2 e PAD4, i prodotti della RT-PCR verranno separati su gel di UREA/acrilamide al 7% e le bande visualizzate con colorazione al Nitrato d'argento. Immagini del gel verranno scannerizzate densitometricamente ed analizzate mediante l'utilizzo del Software Gel-Pro-Analyzer (Media Cybernets). Ciascuna Caspasi e PAD verrà misurata ed espressa come rapporto tra assorbanza del prodotto di PCR del gene d'interesse e di quello del gene standard (18S ribosomiale).
Verrà valutata, inoltre, l'espressione delle proteine specifiche Caspasi 8 e 3 e PAD2 e PAD4 in immunoblotting su lisato totale dei linfociti dei pazienti e dei soggetti sani e correlata all'espressione dell'RNAm specifico per tali enzimi.
Inoltre, l'espressione di Caspasi e PAD, sia a livello di RNAm che proteico, verrà correlata alle manifestazioni cliniche in atto, all'attività di malattia ed al titolo di anticorpi anti-CCP.
Sulla base dei dati ottenuti a livello periferico, l'espressione di Caspasi 3 e 8 e PAD2 e PAD4 e dei rispettivi RNAm verranno indagate anche a livello delle articolazioni interessate su macrofagi e granulociti del liquido sinoviale in correlazione all'andamento clinico della malattia ed al titolo di anticorpi anti-CCP.
I dati ottenuti presso la nostra Unità di Ricerca verranno elaborati ed integrati con quelli ottenuti presso gli altri centri.

Raccolta dati e campioni biologici per la realizzazione del progetto generale.
I dati ed i campioni biologici dei pazienti affetti da AR verranno raccolti e condivisi con le altre Unità di Ricerca per la realizzazione del progetto generale. Per la raccolta si seguiranno le indicazioni ed i criteri descritti dettagliatamente nel Modello A. Attualmente, il nostro database contiene i dati di 350 pazienti affetti da AR, sottoposti a varie terapie e con un follow-up medio di 2 anni.