RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Strategie innovative per la diagnosi e terapia del mesotelioma maligno della pleura

Università di riferimento

Università Politecnica delle MARCHE - PATOLOGIA MOLECOLARE E TERAPIE INNOVATIVE - ANCONA(AN)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Antonio Domenico PROCOPIO

Descrizione

Questo studio è suddiviso in quattro fasi, e coprirà un periodo di due anni. Per primo, si verificherà la presenza di fibroblasti associati al tumore e si caratterizzerà la natura delle cellule immunitarie infiltrate in biopsie di MM; quindi, si valuterà il ruolo dei CAF e delle cellule infiammatorie nel MM. Ci concentreremo sui meccanismi per cui lo stroma favorisce la proliferazione e la progressione della massa tumorale, stimolando la migrazione, l'invasione, l'immunosoppressione e l'attivazione dell'angiogenesi in cellule di MM. Si studierà il ruolo mutagenico della componente stromale nella tumorigenesi. Infine, sulla base dei dati ottenuti nella parte iniziale dello studio, si svilupperanno e si sperimenteranno strategie innovative di rapido trasferimento nella clinica. Gli obiettivi principali che ci proponiamo di raggiungere sono:

FASE 1.
a) Identificazione e caratterizzazione di CAF in biopsie di MM e in essudati pleurici (Tempo richiesto: 6 mesi).
Si identificherà, per immunocitochimica, la presenza di CAF e di cellule immunitarie in biopsie umane di MM. Per i CAF si utilizzeranno i marcatori alpha-SMA (alpha-actina del muscolo liscio), vimentina, FAP (proteina di attivazione dei fibroblasti) e attività β-galattosidasica.
L'immunoistochimica per alpha-SMA, vimentina e FAP, sarà eseguita su sezioni derivate da mesotelio reattivo (n=20) e adenocarcinoma infiltrante il polmone (n=25). Le sezioni saranno colorate con ematossilina e trattate con anticorpi primari specifici, mentre la positività alla β-galattosidasi sarà confermata con il kit per la valutazione della senescenza (Oncogene). Per l'immunoistochimica si ricorrà al metodo indiretto avidina-biotina standard. Per ogni caso, le sezioni saranno marcate con anticorpi anti-CD34 e anti-CD-31 per distinguere, rispettivamente, le cellule non senescenti dalle cellule endoteliali.
Per le cellule immunitarie, si caratterizzeranno le diverse sottopopolazioni di DC e di linfociti T. Per le DC immature (iDC), capaci sia di attivare i linfociti Treg soppressivi sia di inibire le cellule T, e per le DC mature (mDC), si utilizzeranno anticorpi anti-CD83, CD80 e CD86. Poiché, i fattori del microambiente tumorale possono stimolare le DC affinché esprimano B7-H1, intaccando così la capacità delle stesse DC di iniziare una risposta immunitaria specifica per il tumore, nei campioni bioptici di MM si verificherà anche la presenza delle DC B7-H1+. Inoltre, con anticorpi specifici per la indoleammina 2,3-diossigenasi (IDO), si studieranno le cellule dendritiche IDO-positive che bloccano il ciclo cellulare dei linfociti T promuovendo, di conseguenza, la loro morte per apoptosi o l'instaurarsi di uno stato di anergia. Quindi, si valuterà la presenza sia delle cellule dendritiche di origine vascolare e linfocitaria con attività stimolanti per l'angiogenesi, sia dei linfociti Treg, utilizzando, nell'ultimo caso, anticorpi per immunoistochimica e citofluorimetria specifici per CTLA4, CD25 e CD4. Infatti, i pazienti malati di cancro mostrano un numero aumentato di linfociti Treg CTLA4+CD4+CD25+ sia in circolo che in prossimità della massa tumorale. Le cellule CD4+ verranno isolate dagli essudati pleurici e dai campioni di sangue di pazienti affetti da MM mediante biglie MACs CD4 (Myltenyi Biotec). Si studierà anche la sottopopolazione di Treg positivi al PD-1. Gran parte dei campioni, 65 biopsie di MM, necessari per l'attuazione di questo progetto sono già disponibili; mentre altri 45 saranno messi a disposizione dall'unità II. La diagnosi istopatologica sarà ogni volta confermata e un comitato etico provvederà all'approvazione dello studio.

FASE 2. Definire le vie metaboliche attivate dalle CAF e coinvolte nella progressione del MM (Tempo richiesto: 12 mesi)
a)Risposta migratoria di cellule di MM ai CAF e a CM derivati da CAF. I CAF esprimono fattori di crescita e citochine che possono promuovere la migrazione e l'invasione tumorali. Perciò, si esaminerà l'effetto sulla motilità cellulare dei CAF o di mezzi condizionati (CM) da loro derivati. La migrazione e l'invasione cellulare saranno valutate come descritto (Saiki et al., 1990. Jpn Cancer Res 81, 1003-11). I CM derivati dai CAF e dalle cellule mesoteliali primarie, saranno testati per la loro attività chemiotattica sia su cellule di MM, sia su cellule di cancro del polmone. Dal tessuto tumorale e dalla mucosa normale circostante di 10 pazienti affetti da MM e sottoposti a terapia chirurgica, si ricaveranno, rispettivamente, i miofibroblasti primari ed i fibroblasti. I miofibroblasti dovranno essere positivi per più del 95% a vimentina, prolil 4-idrolasi, e α-SMA, e meno del 5% alla miosina del muscolo liscio; e negativi alla citocheratina. I fibroblasti, invece, dovranno essere positivi per più del 95% a vimentina e prolil 4-idrolasi, e meno del 5% a α-SMA e miosina del muscolo liscio; e negativi alla citocheratina. Entrambi saranno utilizzati, rispettivamente, fino al decimo e quinto passaggio. Come controllo, si utilizzeranno miofibroblasti derivati, in vitro, da fibroblasti, come già descritto (De Wever et al., 2004. FASEB J 18, 1016-18). Il CM di cellule mesoteliali o miofibroblasti sarà utilizzato dopo 48 ore di coltura. Successivamente, si effettueranno studi di neutralizzazione per confermare la specificità e la risposta chemiotattica. Le cellule verranno pre-incubate con dosi diverse di anticorpi monoclonali per VEGF, bFGF, Sema-3A e SCF, oppure con inibitori farmacologici specifici per le vie metaboliche della lipoossigenasi e/o della cicloossigenasi.
b) Co-colture di cellule di MM e CAF. Si analizzerà se i CAF possono stimolare la proliferazione delle cellule di MM, che verranno piastrate su un tappeto di CAF non proliferanti. Cinque linee cellulari di MM, precedentemente descritte (28), verranno pre-incubate e piastrate su uno strato di fibroblasti in un mezzo deficitario di fattori di crescita. Si useranno anche colture primarie di cellule mesoteliali umane, che, al pari dei fibroblasti, hanno ridotta capacità replicativa e di cui non si conoscono mutazioni che predispongano alla malignità. Le culture saranno fissate e colorate con Blu di Rodanile o DAPI che evidenzia principalmente le cellule tumorali. In alternativa, si esprimerà il gene reporter EGFP in cellule di MM, la cui fluorescenza sarà misurata con procedure standard.
c) Effetti dei CAF o dei CM da essi derivati sulla maturazione delle DC e sull'attivazione dei linfociti Treg. La maturazione delle DC viene bloccata da alcuni fattori del microambiente tumorale. Quindi, si studieranno gli effetti dei CAF e dei loro CM sui processi di maturazione e regolazione delle DC. Brevemente, i PBMC verranno isolati per gradiente di densità Ficoll, e i monociti secondo protocolli standard. I CM dei CAF verranno aggiunti in diversi momenti del processo maturativi delle DC o, in alternativa, si allestiranno co-colture di monociti con i CAF. Le DC mature ed immature verranno caratterizzate per immunofluorescenza e analisi citofluorimetrica. Si studieranno anche gli effetti dei CM dei CAF, o delle DC o di entrambi i tipi cellulari sull'attivazione e sul differenziamento dei linfociti Treg.
d) Effetto delle cellule di MM sulla maturazione delle DC e sull' attivazione dei linfociti Treg. I monociti verranno piastrati su un tappeto di cellule di MM confluenti per il 50-80% e, quindi, stimolati per il differenziamento in DC. In parallelo si studieranno gli effetti delle cellule di MM o dei loro CM sui linfociti Treg. Le cellule T CD4+ naïve verranno selezionate in modo positivo dal sangue periferico di donatori sani mediante il kit CD4/CD45RA Multisort Kit (Myltenyi Biotec).
e) Effetto dei CAF e delle cellule di MM sull'apoptosi dei linfociti T. Si partirà dall'ipotesi che il microambiente tumorale e, in modo particolare, i CAF e le stesse cellule di MM, possono sensibilizzare i linfociti T all'apoptosi. A tale scopo, linee umane di cellule T (Jurkat e Hut78) o cellule T CD4+ o CD8+, isolate e attivate con IL-2 e anti-CD3 (OKT3), verranno piastrate con i CAF o le cellule di MM o con entrambi, e gli effetti sulla induzione dell'apoptosi delle cellule T verrà analizzata al citofluorimetro dopo colorazione con annessina-V FITC o con ioduro di propidio.
f) Tumorigenesi. Per verificare se i CAF creano un microambiente in grado di promuovere la proliferazione delle cellule di MM in vivo, si inietteranno in topi nudi (nu/nu) cellule di MM, o cellule mesoteliali immortalizzate, non tumorigeniche, che esprimono l'antigene-T di SV40 (Met-5A), da sole o insieme ai CAF. Si useranno anche cellule di MM o cellule Met-5A che esprimono EGFP per confermare che i tumori hanno origine dalle cellule mesoteliali iniettate. Gli animali saranno sacrificati in tempi diversi per studiare gli effetti dei CAF a livello macroscopico, microscopico e ultrastrutturale. La sopravvivenza di gruppi trattati con cellule mesoteliali più CAF, verrà confrontata con quella dei gruppi in cui sono state iniettate solo cellule mesoteliali. Novanta giorni dopo il trapianto, i topi saranno sacrificati, pesati e si eseguirà una autopsia. Si valuterà anche la presenza di metastasi epatiche e l'entità di disseminazione del cancro nel peritoneo.

FASE 3. Analisi genetica dei geni attivati dai CAF in cellule di MM e nelle Met-5A(Tempo richiesto: 8 mesi).
Le cellule tumorali,spesso, acquisiscono meccanismi diversi che consentono loro di espandersi nell'organismo ospite. Uno di questi consiste nella resistenza all'apoptosi e nella capacità di contrattaccare il sistema immunitario, eliminando i linfociti T per apoptosi. Questa resistenza può dipendere da diversi fattori; come, ad esempio, dall'aumentata espressione di MDR1, una proteina di membrana specializzata nell'eliminazione dalle cellule dei chemioterapici o dei loro derivati (Baldini N, 1997. Nat Med 3,378-380). In altri casi possono verificarsi mutazioni importanti del gene onco-soppressore p53, o può venire aumentata l'espressione di proteine antiapoptotiche come Bcl-2. L'apoptosi dei linfociti T attivati, dall'altro lato, è causata da citochine proapoptotiche, come FasL, che vengono espresse sulla membrana delle cellule cancerose.
a) Capacità dei CAF di promuovere la resistenza alla morte cellulare e l'attività proapoptotica delle cellule tumorali contro gli effettori del sistema immunitario. I livelli di mRNA di MDR1 e di FasL di cellule di MM e delle Met-5A, in co-coltura con i CAF, verranno quantizzati per northern blot. In parallelo, si esaminerà anche l'espressione di entrambe le proteine mediante citofluorimetria. Inoltre, si correlerà l'espressione di MDR1, determinata dai CAF, con la suscettibilità all'apoptosi indotta da diversi stimoli. L'inattivazione del gene MDR1 con il siRNA specifico potrebbe risensibilizzare alla terapia le cellule esposte a CAF. Si utilizzeranno stimoli di morte immunologici (FasL e TRAIL) e chimici. La percentuale di cellule apoptotiche verrà stabilita come descritto sopra. Per saggiare la capacità delle cellule di MM di indurre apoptosi nei linfociti T si allestiranno esperimenti di co-coltura. Per studiare la citotossicità si utilizzeranno i kit specifici disponibili in commercio. Per verificare l'ipotesi che il FasL esposto sulla membrana delle cellule cancerose è in grado di uccidere i linfociti T effettori, si utilizzeranno anticorpi bloccanti o siRNA specifici per FasL. Allo stesso modo, la linea cellulare Jurkat verrà trasfettata con siRNA specifici per Fas. Utilizzando il sFasL ELISA kit, si verificherà anche la presenza del FasL solubile nei mezzi condizionati ottenuti da cellule mesoteliali sia tumorali sia normali così come negli essudati pleurici e nei sieri di pazienti affetti da MM.
b) Effetti delle semaforine secrete. E' stato dimostrato che diverse semaforine secrete possono regolare la migrazione e l'invasione delle cellule tumorali. In particolare, la semaforina 3A (Sema-3A), ligando del complesso recettoriale di membrana neuropilina-1/plexina-A1, è implicato nella regolazione degli effetti biologici di VEGF. Si analizzerà la capacità dei CAF di regolare la propagazione tumorale modulando l'espressione delle semaforine secrete di classe 3. A tal fine, linee cellulari di MM o Met-5A in co-colture con CAF, saranno confrontate con colture cellulari di controllo, mediante real-time RT-PCR (MJ Research) e sequenziamento del DNA, per la loro capacità di esprimere le Sema-3A, -3B, -3F e -3C. Le proteine identificate verranno analizzate per Western blot usando anticorpi monoclonali specifici.
c) Effetto dei fattori del microambiente sulla resistenza all'apoptosi delle cellule di MM e sulla regolazione delle cellule immunitarie. Si valuterà se alcuni fattori del microambiente tumorale, come il VEGF, l'FGF-2, il PDGF, il TGF-β, il PGE2 e le Semaforine possono influenzare i) l'espressione, nelle cellule di MM, di geni antiapoptotici come, ad esempio, FLIP; ii) il differenziamento, la maturazione e le funzioni delle DC e iii) lo sbilanciamento tra linfociti Treg e T effettori. Dopo aver aggiunto al mezzo di coltura privo di siero, una o più proteine ricombinanti si analizzeranno i livelli delle proteine antiapoptotiche e dei marcatori di differenziamento delle diverse popolazioni di cellule immunitarie, mediante real-time RT-PCR, western blot e citofluorimetria. I sottogruppi di linfociti T saranno determinati per citofluorimetria utilizzando anticorpi specifici per i vari marcatori.

FASE 4. Effetto di "normalizzazione" dell'ambiente stromale su modelli pre-clinici di MM (tempo richiesto: 6-8 mesi).
I risultati ottenuti nelle prime fasi del progetto, potrebbero individuare nel microambiente tumorale importanti bersagli per la terapia del MM. Pertanto, si combineranno più farmaci, selettivi per diversi aspetti dello stroma attivato, con terapie citotossiche dirette contro le cellule di MM. Si utilizzeranno inibitori della via metabolica della lipossigenasi (zileuton), dell'angiogenesi (bevacizumab), delle cellule infiammatorie e delle citochine (celecoxib), e farmaci immuno-modulatori (AMD3100) per il trattamento di topi nudi con trapianto ortotopico di cellule di MM. Questi farmaci saranno poi combinati con il pemetrexed, un anti-folato largamente utilizzato per il trattamento del MM, o con derivati della vitamina E, che saranno forniti dalla III unità di questo progetto.
a) Studi in vitro. Si utilizzeranno i farmaci: Zileuton (inibitore della 5-lipossigenasi), bevacizumab (anticorpo VEGF-bloccante), Transtuzumab (anticorpo ERBB2-bloccante), Celecoxib (inibitore della COX-2) e AMD3100 (antagonista di CXCR4); alcuni già utilizzati in protocolli di sperimentazione clinica contro tumori solidi. Le cellule di MM saranno trattate a dosi crescenti di farmaco e monitorate giornalmente per la proliferazione cellulare con il saggio dell'MTT. Per ogni linea cellulare si determinerà il valore di IC-50 (dose in cui si ha il 50% di inibizione di crescita cellulare). L'inibizione della proliferazione e altri possibili effetti indotti da questi agenti, saranno analizzati per citofluorimetria e microscopia a fluorescenza dopo colorazione con Hoechst33258.
b) Studi in vivo. Gli stessi farmaci saranno sperimentati, singolarmente, su topi nudi balb/c atimici, ad una settimana dall'inoculo i.p. di 3 milioni di cellule di MM, alla concentrazione di 25 microL in associazione con pemetrexed. I topi saranno sacrificati in tempi diversi per valutare l'effetto dei farmaci a livello macroscopico, microscopico e ultrastrutturale. La sopravvivenza dei gruppi trattati sarà, quindi, confrontata con quella dei gruppi non trattati. Per gli xeno-trapianti si utilizzerà i) la linea cellulare MM-B1 di MM poco differenziato e ii) la linea cellulare H-meso di mesotelioma epitelioide. Dopo 60 giorno dal trapianto, i topi saranno sacrificati, pesati e si eseguirà l'autopsia. Si valuterà la presenza di metastasi epatiche e la disseminazione peritoneale/pleurica.