RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Cause, conseguenze, e aspetti terapeutici dell'iperomocisteinemia nell'uremia e nel diabete.

Università di riferimento

Seconda Università degli Studi di NAPOLI - PEDIATRIA - CASERTA(CE)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Natale Gaspare DE SANTO

Descrizione

Il programma di ricerca comprende varie fasi, che possono essere brevemente riassunte in:
1) Fase 1, che mira ad caratterizzare gli effetti delle proteine omocisteinilate su cellule in cultura, e monociti estratti da pazienti e controlli. Tali esperimenti saranno in parte effettuati in collaborazione con l'unità del Prof. Ingrosso.
2) Fase 2, che mira a determinare gli effetti della carbamilazione delle proteine sull'omocisteinilazione dell'albumina umana.
3) Fase 3, studi sull'espressione del recettore dei folati in cellule ottenuto da sangue periferico, prima e dopo trattamento con folati. Anche questi studi saranno in parte svolti in collaborazione con l'unità del Prof. Ingrosso.

Pazienti e controlli. Sarà necessario selezionare un congruo numero di pazienti e adeguati controlli, paragonabili per sesso ed età, che saranno arruolati per donare il sangue utilizzato nelle varie fasi dello studio. I controlli sani saranno reclutati tra il personale medico e paramedico dell'Università. Pazienti uremici cronici in trattamento emodialitico sostitutivo verranno reclutati presso il Servizio di Emodialisi dell'Università. I pazienti saranno selezionati tra quelli in condizioni cliniche stabili, in emodialisi cronica da più di sei mesi, con un Kt/V > 1.4, e che non presentino patologie sistemiche concomitanti quali tumori, diabete mellito, lupus eritematoso sistemico, etc. Il sangue verrà prelevato a digiuno, prima della seduta emodialitica, il plasma immediatamente separato dalla frazione corpuscolata, e congelato a –20°C. Il trattamento con folati verrà effettuato su di un gruppo di pazienti in emodialisi preventivamente sottoposti a washout per un periodo di due mesi, quindi senza terapie che comportino l'utilizzo di folati. Il trattamento verrà effettuato con metiltetraidrofolato cpr per os 15 mg tre volte alla settimana per due mesi. La compliance sarà controllata dall'operatore sanitario che somministrerà personalmente le compresse alla fine della seduta emodialitica. Il prelievo ematico verrà effettuato prima ed alla fine dei due mesi di terapia.

Fase 1: Esperimenti in vitro utilizzando albumina omocisteinilata incubata con cellule endoteliali umane in cultura.

L'albumina umana (10 mg/ml) verrà omocisteinilata incubando overnight, a 37° C, con omocisteina tiolattone a concentrazione 5 mM finale, in buffer 0.1 M sodio fosfato (pH 7.4)/0.2 mM EDTA. Successivamente, si procederà a diafiltrazione per allontanare l'omocisteina tiolattone che non ha reagito.
Le cellule endoteliali umane (HUVEC) verranno isolate da cordoni ombelicali dopo opportuni lavaggi con PBS ed incubazione contenente collagenasi. Dopo digestione il pool cellulare verrà centrifugato a 100 x g per 5 min. Eliminato il supernatante, si laverà due volte il pellet con PBS. Il pellet cellulare sarà risospeso in capsule di Petri (da 10 cm di diametro) con terreno di coltura. Per la crescita delle cellule endoteliali si utilizzerà terreno M199 contenente 20 % (v/V) di siero fetale e bovino, 20 mg/ml di fattori di crescita, 100 mg/ml di penicillina, e 100 mg/ml di streptomicina, in un incubatore umidificato a 37 °C con aria/CO2 (19:1). Le colture primarie arrivate a confluenza saranno trattate con tripsina allo 0.05 %, ed EDTA 0.02 %, recuperate e trasferite su membrane di policarbonato (6.5 nm di diametro, 3 mm di grandezza dei pori) di una piastra contenente 24 pozzetti.
Quando le cellule endoteliali adese alla membrana raggiungeranno la confluenza, saranno lavate con una soluzione di Krebs contenente: NaCl 118 mM, KCl 4.8 mM, CaCl2 2.5 mM, MgSO4 1.2 mM, KH2PO4 1.2 mM, NaHCO3 2.4 mM, glucosio 11 mM, ed HEPES, a 37 °C a pH 7.4. Le membrane con le cellule endoteliali saranno alloggiate nella piastra da 24 pozzetti contenente due camere (inferiore e superiore) separate dalla membrana di policarbonato. Nella camera inferiore saranno dispensati 100 ml di soluzione di Krebs, mentre nella camera superiore 100 ml di soluzione di Krebs contenente 4 % di albumina omocisteinilata, o il controllo (albumina), marcate con Trypan Blu (180 mg di Trypan Blu e 4 g di albumina umana sciolti in 100 ml di soluzione di Krebs). Le cellule umane saranno incubate per 90 minuti a 37 °C con albumina umana omocisteinilata in un bagnetto orbitale agitante. Allo scopo di determinare se l'albumina omocisteinilata induce alterazioni della barriera endoteliale, si utilizzerà come rivelatore il Trypan blu. Come controllo si utilizzerà albumina umana non omocisteinilata marcata. Dopo incubazione, i campioni saranno rimossi, e sarà misurata l'assorbanza a 590 nm per stabilire la quantità di albumina marcata con Trypan blu. Il trasferimento di albumina marcata nelle cellule endoteliali sarà così quantizzato ed espresso come percentuale, dove il 100 % rappresenta il massimo che è possibile raggiungere all'equilibrio (27).
Sarà inoltre effettuato l'isolamento di monociti da sangue di soggetti normali e di pazienti uremici cronici in emodialisi, e saranno studiati gli effetti dell'albumina omocisteinilata su parametri di funzionalità in vivo delle cellule. I monociti saranno isolati dal sangue intero dei soggetti di controllo e dai pazienti utilizzando la metodica Rosette-Step. Questa metodica utilizza un complesso di anticorpi tetramerici che si legano alle cellule da eliminare ed ai globuli rossi formando immunorosette. Il sangue viene incubato, a temperatura ambiente, con gli anticorpi tetramerici specifici, e successivamente stratificato su di un uguale volume di Ficoll-PaqueTM PLUS density gradient (Amersham) e centrifugato a 1200 g per 30 secondi a temperatura ambiente. I monociti, che si stratificheranno all'interfaccia tra Ficoll e il plasma, saranno prelevati, lavati in PBS e sospesi nel terreno RPMI.
I monociti così isolati con tale metodica e provenienti da soggetti sani di controllo verranno incubati con albumina umana omocisteinilata, e successivamente verrà misurato il rilascio di interleuchine (IL-1, IL-6, metodo ELISA) nel mezzo dopo incubazione. Ciò allo scopo di verificare se l'albumina omocisteinilata può determinare una variazione di questi parametri di funzionalità dei monociti. Il rilascio di interleuchine verrà anche valutato nei monociti di pazienti uremici cronici in trattamento emodialitico, e si correlerà il dato ottenuto con l'omocisteinemia.
Lo studio di tutte le possibili correlazioni, tra albumina omocisteinilata, omocisteina, e i vari parametri di funzionalità e danno endoteliale, sarà utile quindi alla comprensione di aspetti quali: a) se le proteine omocisteinilate abbiano un effetto di tipo tossico sull'endotelio, ed b) considerando che le proteine omocisteinilate riflettono un'esposizione a lungo termine all'iperomocisteinemia nell'uremia, se ciò ha conseguenze funzionali.

Fase 2. Effetti della carbamilazione delle proteine sull'omocisteinilazione delle proteine stesse.
Nella valutazione dell'ipotesi che la carbamilazione delle proteine possa interferire con il grado di omocisteinilazione, si attuerà il protocollo di omocisteinilazione dell'albumina umana includendo l'incubazione con urea. L'urea si trasforma spontaneamente in ione cianato se incubata a 37°C, con aumento della quota in funzione del tempo.
Si procederà dunque incubando l'albumina umana (60 mg/1.5ml) con l'omocisteina tiolattone (20 mM) in presenza di un tampone fosfato NaH2PO4 0.1 M (5X), pH 7.4, e in presenza di urea 0.165 M preparata al momento, oppure di urea 0.165 M incubata per 3 giorni a 37°C. Al termine dell'incubazione si procederà allontanando ciò che non ha reagito con un passaggio su colonnine PD-10 Sephadex G-25 e si raccoglierà la proteina legata con legame ammidico e con urea in un'aliquota di 3.5 ml. Da tale aliquota si preleveranno 900 microlitri e si aggiungeranno 90 microlitri di tri-n-butilfosfina (TBF, Sigma, St. Louis, Missouri) in dimetilformammide (in ragione di 1/10 v/v). Ad un'altra aliquota (900 microlitri), usata come controllo non ridotto, si aggiungeranno 90 microlitri di H2O, e si incuberà a 4°C per 30 minuti. Con la riduzione si stacca l'omocisteina legata mediante ponte disolfuro alle proteine. Per allontanare l'omocisteina staccata, si procede alla separazione per gel filtrazione con colonnine PD-10 Sephadex G-25 (Amersham Biosciences, Uppsala Sweden). I campioni non ridotti subiscono gli stessi passaggi del campione ridotto. Dalle colonnine si raccoglie un volume di 3.5 ml contenente nel caso del campione ridotto la proteina con omocisteina legata con il solo legame ammidico, mentre il campione non ridotto conterrà la proteina con legata l'omocisteina legata sia con legame ammidico che con ponte disolfuro.
Le aliquote proteiche (3.5 ml) saranno così processate: a 300 microlitri di aliquota non ridotta verranno aggiunti 30 microlitri di TBF e dopo incubazione a 4°C per 30 minuti, si addizioneranno 300 microlitri di TCA al 10% per precipitare le proteine, e si centrifugherà a 10000 rpm per 10 minuti. Si preleveranno 100 microlitri del supernatante e si procederà alla derivatizzazione con 20 microlitri NaOH, 250 microlitri di buffer borato, 100 microlitri di SBD-F e si incuberà a 60°C per 1 ora. Si utilizzano 20 microlitri per l'analisi all'HPLC. In tal modo si valuta la quantità di omocisteina legata alle proteine con ponte disolfuro.
A 300 microlitri dell'aliquota ridotta si aggiungeranno 30 microlitri di TBF (si riducono in tal modo eventuali gruppi –SH che si autoossidano), si incuberà a 4°C per 30 minuti e si aggiungeranno 60 microlitri di NaOH, 750 microlitri di buffer, 300 microlitri di SBD-F, e si incuberà a 60°C per 1 ora. Il campione verrà portato al volume di 2.5 ml e stratificato su colonnina. L'aliquota raccolta (3.5 ml), contenete solo l'omocisteina legata alle proteine con legame ammidico, verrà idrolizzata sottovuoto con HCl 6 N a 114°C overnight, utilizzando provette da idrolisi e il Reacti-Therm III Heating module (Pierce, Rockford, IL). Si porterà a secco il campione e lo si risospenderà in 500 microlitri di acqua distillata. Per l'analisi all'HPLC si utilizzeranno 20 microlitri.


Fase 3. Esperimenti sull'espressione del recettore dei folati in cellule di sangue periferico da pazienti uremici e controlli.
I monociti saranno isolati dal sangue intero dei soggetti di controllo e dai pazienti utilizzando la metodica Rosette-Step, già precedentemente descritta. I monociti, che si stratificheranno all'interfaccia tra Fycoll-Hpaque e il plasma, saranno prelevati, lavati in PBS e risospesi nel terreno RPMI 1640 (Gibco). I monociti così isolati saranno lisati con un buffer contenente: 2% SDS, 20 mM EDTA, 1 microg/ml di aprotinina e 1 mM PMSF (SIGMA), allo scopo di ottenere le proteine di membrana.
Le proteine di membrana verranno separate mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide (SDS-PAGE). La metodica prevede una "pre-corsa" nello stacking gel: acrilammide 4% (w/v), tampone Tris HCl 1.5 M, pH 8.8; APS 10% e Temed 0.01%. Saranno caricati 15 µg di proteine mescolate con tampone di carico 4 X (tampone Tris HCl 0.5 M, pH 6.8, glicerolo 40%, Blu di bromofenolo 0.01%). La separazione elettroforetica sarà fatta applicando una corrente di 100-150 V fino a quando il Blu di bromofenolo (tracciante elettroforetico) non raggiungerà il gel di risoluzione, successivamente si applicherà una corrente di 200 V fino alla fuoriuscita del tracciante dal gel. Dopo la separazione delle proteine mediante SDS-PAGE, queste saranno trasferite su una membrana di nitrocellulosa mediante elettroblotting. Il trasferimento sarà effettuato per 20 ore a 0.8 mA x cm2 in presenza di tampone di trasferimento: Tris-Base 48 mM, glicina 39 mM e metanolo 10%. Dopo il trasferimento, la membrana verrà pre-ibridata con una soluzione TPBS costituita da PBS 1 x (Tris HCl 100 mM, NaCl 1.5 M) Tween 20 0,05%, latte al 5%. L'incubazione procederà per 30 minuti a temperatura ambiente su agitatore orbitale. Si allontanerà la soluzione di pre-ibridazione e si incuberà il filtro con l'anticorpo primario diluito in T-PBS (1: 1500) per 4h a temperatura ambiente su agitatore orbitale (come anticorpo primario verrà utilizzato quello contenuto nel rabbit polyclonal anti-human placental FR antiserum, SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY). Si laverà la membrana 2 volte con la washing solution: PBS 1 X e Tween 20 a 0.05% per 15 minuti. Seguirà l'incubazione con anticorpo secondario diluito in T-PBS (1: 15000) per 2h a temperatura ambiente su agitatore orbitale. Seguiranno 3 lavaggi in T-PBS per 15 minuti, l'ultimo lavaggio sarà in PBS. La membrana sarà trattata per 1 minuto con una mix di sviluppo (Kit ECL Amersham cod. RPN 2108). Si eliminerà il liquido in eccesso dalla membrana e si esporrà per un tempo compreso tra 30 secondi ed 1 minuto ad una lastra autoradiografica per la rivelazione del segnale. Il segnale corrisponde quindi alla proteina-recettore espressa dalle cellule, che potrà essere così evidenziata e quantizzata.
Si procederà poi all'analisi quantitativa dell'RNA messaggero del recettore dei folati nei pazienti e nei controlli mediante la tecnica del Northern blot. L'RNA totale sarà estratto utilizzando il metodo guanidina/tiocianato/fenolo/cloroformio in singolo step (Promega); dell'RNA estratto 15 microgrammi saranno sottoposti ad elettroforesi su gel di agarosio 1.0% / 2.2M di formaldeide. Il blotting e l'ibridizzazione sarà fatta usando membrane in nylon Hybond-N (Amersham). L'RNA sarà trasferito alla membrana di nylon attraverso blot capillare usando 20X SSC (3 M Cloruro di Sodio, 0.3 M Citrato di Sodio) come buffer di blot. Dopo 16 ore di trasferimento, l'RNA sarà fissato alle membrane per 2 ore in una stufa a 80°C. Si ibridizza con sonda di cDNA marcata con [digossigenina]-dUTP, si incuba a 60°C per 16 ore, in seguito la membrana sarà lavata con un buffer 0.1 X SSC, SDS 1% per 5 minuti 2 volte. A questo punto si prepara l'anticorpo secondario anti-digossigenina e si incuba per 30 minuti a temperatura ambiente (kit PCR DIG, Roche), le membrane saranno lavate con una soluzione di 1 X PBS e 0.1% Tween 20 e sviluppate utilizzando il kit per luminescenza DIG (Roche) seguita da una esposizione ad una lastra autoradiografica per circa 30 minuti a temperatura ambiente per la rivelazione del segnale. I dati relativi all'espressione dell'mRNA del recettore dei folati saranno normalizzati per il corrispondente mRNA della b-actina usando un sistema digitale per immagini.
Per valutare in modo più preciso il grado di espressione genica del recettore dei folati si procede alla retro-trascrizione dell'RNA totale estratto usando primers arbitrari di 6 bp (Applied Biosystem), in presenza di un inibitore della RNAsi RNasin (Promega) e della trascrittasi inversa MMLV (Promega), dNTP 1.0 mM, MgCl2 (5.0 mM) e buffer di reazione (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8.3). La mix di reazione sarà incubata per 10 minuti a temperatura ambiente e successivamente a 42°C per 15 minuti. La reazione verrà bloccata esponendo la mix di reazione a 99°C per 10 minuti.
Tutti i prodotti della retro-trascrizione saranno amplificati e quantizzati mediante real-time PCR. Questa tecnica di indagine quantitativa ci permette di monitorare la reazione di PCR durante il suo svolgimento.

I risultati attesi saranno dunque: a) il chiarimento dei meccanismi molecolari di tossicità dell'omocisteina attraverso l'omocisteinilazione delle proteine, e b) possibili interferenze nell'utilizzazione del parametro delle proteine omocisteinilate negli uremici, ed eventualmente la valutazione dell'impiego clinico di questo parametro, e c) comprensione del meccanismi di resistenza ai folati negli uremici.