RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Cause, conseguenze, e aspetti terapeutici dell'iperomocisteinemia nell'uremia e nel diabete.

Università di riferimento

Università degli Studi di GENOVA - MEDICINA INTERNA E SPECIALITA' MEDICHE - GENOVA(GE)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Giacomo GARIBOTTO

Descrizione

Fase I (1° anno)
Valutazione degli effetti dello stato infiammatorio sul metabolismo "whole body" di metionina ed Hcy e sulla produzione di Hcy e di IL-6 da parte dei tessuti periferici
Saranno studiati sia pazienti in terapia emodialitica che presentano evidenza di uno stato microinfiammatorio che pazienti con insufficienza renale cronica e pazienti emodializzati senza evidenza di infiammazione. E' previsto valutare 8-10 soggetti per gruppo. La presenza di infiammazione sarà definita dal riscontro di valori di Proteina C Reattiva >10 mg/l in tre controlli consecutivi eseguiti a distanza di due settimane. Lo studio prevede la valutazione delle vie metaboliche della degradazione della metionina (transmetilazione, remetilazione, transulfurazione) mediante la cinetica della L-[metil-(2)H3, 1-(13)C]-metionina a livello "whole body" e dei tessuti periferici e dell'immissione in circolo di Hcy, IL-6, Cisteinil-Glicina (espressione della degradazione del glutatione) a livello dei tessuti periferici. Lo studio sarà eseguito in condizioni basali, dopo 48-72 ore dall'ultimo trattamento emodialitico, per evitare la coincidenza di possibili effetti metabolici del trattamento stesso. Per evitare possibili effetti legati a carenze, i pazienti saranno supplementati con folati, vitamine B6 e B12 per un mese prima dello studio. La degradazione muscolare del glutatione e l'imissione in circolo di IL-6 sarà determinata dalla misura delle differenze artero-venose moltiplicate per il flusso plasmatico attraverso l¹avambraccio (8). La misura della proteolisi netta (e quindi, indirettamente, della quantità di metionina proveniente dal bilancio proteico che compare nel muscolo) e del bilancio proteico netto sarà effettuata mediante il metodo della perfusione dell'avambraccio associato alla misura delle differenze artero-venose di fenilalanina. Al mattino alle 7. una vena periferica sarà incannulata con un catetere di Teflon per l'infusione dell' isotopo. Un campione di sangue sarà raccolto prima dell'infusione per la misura degli "enrichments" basali. Seguirà, mediante l'uso di pompe calibrate, l'infusione del tracciante. Saranno successivamente introdotti un catetere nell'arteria brachiale controlaterale e, in via retrograda, nella vena profonda dell'avambraccio. Dopo un periodo di equilibrio di 180 min, saranno eseguiti prelievi dall'arteria e dalla vena, ad intervalli di 20 min. per un periodo di 60 min. I campioni di sangue saranno raccolti in provette fredde contenenti EDTA e queste immediatamente centrifugate a 4000 rpm per 10 min a +4°C. Il plasma sarà velocemente separato dalle cellule del sangue e posto a -80°C fino all'analisi. Gli aminotioli totali saranno determinati in triplicato (8). Metionina e fenilalanina saranno misurate in triplicato mediante amino acid analyzer (Mod. 3A30, Fisons Instr. Milano, Italia) (8). Gli arricchimenti isotopici di L-[metil-(2)H3, 1-(13)C]-metionina saranno determinati mediante Gas Chromatography Mass Spectrometry (GCMS)(14). Livelli plasmatici di Folati, Vit.B6 e B12 saranno misurate mediante RIA. L'interleuchina 6 (IL-6) sarà valutata mediante ELISA. L'ematocrito sarà valutato con tecnica microcapillare. I calcoli per la misura del bilancio netto di aminotioli, della degradazione del GSH, del bilancio proteico netto e delle vie metaboliche della metionina (transmetilazione, remetilazione, transulfurazione) saranno descritti come in precedenza(14). I risultati relativi alle vie di transulfurazione, transmetilazione e remetilazione saranno posti in relazione ai livelli di Hcy, solfati vitamine e folati oltre che alla funzione renale residua.

Gli arricchimenti isotopici in spettrometria di massa della metionina con doppia marcatura saranno misurati presso il Laboratorio del Prof. Paolo Tessari (Università di Padova).
Lo studio fa parte di un più vasto protocollo sul metabolismo degli aminoacidi e delle proteine approvati dal Comitato Etico del Dipartimento di Medicina Interna dell'Università di Genova.


Fase II (2°anno)

1)Valutazione degli effetti dello stato infiammatorio sul metabolismo "whole body" di metionina e Hcy e sulla produzione di Hcy e di IL-6 da parte dei tessuti periferici.
Saranno proseguiti gli studi iniziati l'anno precedente, per raccogliere una casistica che comprenda 8-10 pazienti per gruppo. Gli studi saranno eseguiti presso il Laboratorio di Nefrologia dell'Unità di Genova, mentre le analisi in spettrometria di massa a Padova.

2)Valutazione degli effetti dell'infusione di solfati sul metabolismo della metionina e dell' omocisteina.

Sarà valutato il metabolismo della metionina e dell'omocisteina in volontari sani, prima e dopo un'infusione acuta di solfati. E' stato suggerito che l'aumento in circolo di solfati che si osserva in corso di insufficienza renale possa inibire con meccanismo "feed-back" la transulfurazione, ed essere alla base della ridotta clearance metabolica dell'omocisteina che si osserva nei pazienti con danno renale cronico. Tuttavia non è stato mai valutato nell'uomo se un aumento dei livelli dei solfati plasmatici modifica le vie del catabolismo della metionina. In volontari sani, al mattino a digiuno, sarà valutata la cinetica della L-[metil-(2)H3, 1-(13)C]-metionina in condizioni basali e dopo infusione (3 ore) di solfato di Mg (60 umol/Kg/ora) (14). E' previsto ottenere livelli plasmatici di solfati aumentati di 2-3 volte rispetto alle condizioni basali. Sarà messa a punto la metodica per la determinazione in HPLC dei solfati plasmatici. Saranno valutati, oltre ai solfati, anche gli arricchimenti isotopici di metionina e Hcy (Laboratorio del Prof Paolo Tessari-Padova). La determinazione dei composti intermedi della transmetilazione (SAM/SAH) sarà eseguita presso il Laboratorio del Prof De Santo (Napoli).