RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Cause, conseguenze, e aspetti terapeutici dell'iperomocisteinemia nell'uremia e nel diabete.

Università di riferimento

Seconda Università degli Studi di NAPOLI - BIOCHIMICA E BIOFISICA "FRANCESCO CEDRANGOLO" - CASERTA(CE)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Diego INGROSSO

Descrizione

SCOPI:
• Identificazione di geni deregolati per ipometilazione in pazienti uremici iperomocisteinemici (ESRD-ipertHcy)
• Identificazione di un'alterata metilazione degli istoni e interazione DNA-istoni in pazienti ESRD-ipertHcy.

Obiettivi specifici:
1. Identificazione di nuovi markers genetici di tossicità dell'Hcy, in pazienti con alterazioni del metabolismo di tale amminoacido, e loro correlazione con i tipici indicatori di aumento del rischio CV e/o di disfunzione endoteliale.
2. Messa a punto di tecnologie di screening per la valutazione di questi markers e loro potenziale applicazione nella diagnostica clinica di routine
3. Valutazione degli effetti di trattamenti terapeutici dell'iper-tHcy (ad es. supplementazione di folato) su questi nuovi markers.

Strategia sperimentale:

1. Creazione di una banca biologica di campioni di DNA, RNA e mononucleati (esposti a cross-link con formaldeide) da pazienti ESRD-ipertHcy e controlli.
- Selezione dei pazienti e test biochimico-clinici di base
I pazienti affetti da insufficienza renale cronica in trattamento emodialitico, tre volte a settimana, saranno selezionati come descritto precedentemente (4). I soggetti patologici o normali saranno classificati come pazienti o controlli normali in base ai valori di GFR e tHcy plasmatica al momento della selezione. Inoltre gli effetti della somministrazione di folati saranno altresì valutati attraverso un doppio campionamento prima e dopo il trattamento con MTHF. I campioni ematici e i relativi dati clinici saranno forniti dal Prof. De Santo, Div. di Nefrologia, Fac. di Medicina, S.U.N. (17). Laddove indicato, ai pazienti sarà somministrato un supplemento orale folati per verificare gli effetti di tale trattamento sulla riduzione dell'iper-Hcy sull'alterazione dell'espressione genica. Test ematologici e biochimici di routine saranno eseguitii su tutti i soggetti all'atto dell'ammissione. Le analisi ematologiche e chimico-cliniche saranno eseguita presso il Dip. di Medicina di Laboratorio della Fac. di Medicina e Chirurgia, S.U.N. Aliquote di campioni di plasma, opportunamente raccolti, saranno utilizzati per la determinazione della concentrazione ematica di Hcy (FPIA; AXSYM; Abbot). Saranno inoltre eseguiti test del profilo di coagulazione e della disfunzione endoteliale (11).
- Valutazione dei livelli di metilazione totale del DNA
Mononucleati periferici verranno ottenuti mediante centrifugazione isopicnica su gradiente di Ficoll da campioni di sangue raccolti in EDTA (1mg/ml). Il DNA verrà estratto con la metodica del fenolo/cloroformio. Sarà valutata la frequenza allelica del più comune polimorfismo del gene MTHFR (C677T) (33,35).
I livelli di metilazione totale di DNA saranno valutati attraverso due differenti metodiche (30). Metodica 1: il DNA sarà digerito con l'enzima di restrizione metilazione sensibile HpaII. I controlli saranno costituiti dalla digestione parallela di aliquote di campioni con l'enzima di restrizione metilazione indipendente MspI. L'efficienza della procedura sarà monitorata usando elettroforesi su gel di agarosio. I campioni di DNA genomico sottoposti a digestione saranno sottoposti al saggio di estensione della citosina, utilizzando Taq polimerasi in presenza di 3H-dCTP (18,28). E' in fase di messa a punto un nuovo metodo per lo screening di un elevato numero di pazienti a scopo epidemiologico, mediante l'uso di un substrato fluorescente per la Taq polimerasi e di un termociclatore real time per il monitoraggio dei prodotti della reazione di fill-in. Metodica 2. Il DNA sarà digerito con un enzima di restrizione metilazione sensibile, McrBC, seguito da un Southern blotting (28). I risultati ottenuti con queste due metodiche saranno correlati a quelli ottenuti con HPLC-MS (20). Gli effetti del trattamento con folato saranno valutati su un gruppo selezionato di pazienti. E' prevista una collaborazione con il Prof. Tessari (Fac. Di Medicina, Univ di Padova) per confrontare la versatilità e il rapporto costi/qualità dei diversi metodi per la determinazione dei valori di metilazione totale del DNA, in vista di un largo impiego in campo clinico.

2. Profilo di espressione genica di trascritti in mononocleati periferici di pazienti ESRD-ipertHcy e controlli
Per identificare l'esistenza di alterazioni dei livelli di espressione analizzeremo il profilo trascrizionale. Campioni di cDNA sono ottenuti mediante RT-PCR di RNA estratto dai mononucleati periferici mediante TrizolTM (Life Tecnoligies, Carlsbad, CA, USA) come descritto precedentemente. Brevemente, 1,5?g di RNA è incubato con 1,5?l (300U) di SuperscriptTM reverse transcriptase, in presenza di 1,0?l di RNaseOUTTM, inibitori delle ribonucleasi ricombinanti e 1,0?l di dNTP 10mM (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA).
Analisi del "Profilo di espressione" Questa fase verrà condotta in collaborazione e con il parziale supporto del Laboratorio di Ricerca sul Genoma e Sequenziamento genico dell'IGB-CNR e della Facility per l'Analisi del Profilo di Espressione, mediante l'utilizzo della tecnologia Affymetrix.Gene chips "ad hoc" verranno derivati dal set Unitene-EST. Il profilo di trascrizione ottenuto mediante gene chips relativo ai pazienti, prima e dopo trattamento con folato, e ai controlli, sarà valutato e paragonato con l'analisi DMH (Vedi sotto). I risultati relativi alla differente espressione di geni metilazione-dipendenti sarà confermata mediante real-time PCR (Bio-Rad, I-Cycler, IQ).

3. Identificazione, nei pazienti ESRD-ipertHcy vs controlli normali, di geni affetti da ipometilazione del promotore a livello delle isole CpG.
Saranno testati anche gli effetti della terapia con folato sulla metilazione differenziale e il profilo trascrizionale (28). Questa fase del programma sarà condotta in collaborazione con il Dott. Maurizio D'Esposito, Laboratorio di Ricerca sul genoma e Sequenziamento – Istituto Internazionale di Genetica e Biofisica "A. Buzzati Traverso" del Consiglio Nazionale delle Ricerche (IGB-ABT, CNR, Napoli). La tecnica nota come "Differential Methylation Hybridization", già applicata con successo per l'analisi di cellule provenienti da carcinoma della mammella, permette uno screening di tutto il genoma per l'individuazione di isole CpG metilate in maniera differenziale (36,37). Essa si basa sulla ibridazione di un CpG-microarray con DNA genomico proveniente da tessuti/cellule patologici vs un controllo adeguato, opportunamente trattati in modo da mettere in evidenza le differenze di metilazione in numerose e specifiche isole CpG contemporaneamente. Nel nostro caso intendiamo migliorare l'efficienza del sistema mediante l'uso di un microarray in cui ogni clone presente sia massimamente caratterizzato, limitando al massimo la ridondanza e la casualità. Quest'ultima è ottenuta attraverso il passaggio di sequenze genomiche attraverso una colonna di affinità verso una proteina legante ad alta efficienza il DNA metilato, MECP2 (38). La produzione dell'amplicone genomico da ibridare al microarray sarà effettuata tramite digestione con MseI di DNA gnomico come descritto per i microarray. Mediante ibridazione sottrattiva Cot-1 verranno eliminate le sequenze ripetute appartenenti alle famiglie AluI e KpnI. Metà del DNA rimanente verrà poi sottoposto a digestione con l'endonucleasi metilazione-sensibile BstUI, il cui sito di riconoscimento, CGCG, ricorre frequentemente nelle isole CpG ma raramente nella restante sequenza del genoma. Il DNA derivante da tale digestione e quello non digerito verranno usati come stampo di una linker-PCR. I frammenti genomici contenenti siti BstUI non metilati saranno stati digeriti e quindi non daranno prodotti di amplificazione nei campioni trattati, mentre gli stessi frammenti saranno amplificati nei campioni-controllo non digeriti. I frammenti contenenti siti metilati BstUI saranno protetti dalla digestione e saranno amplificati mediante una linker-PCR. Il prodotto di amplificazione (amplicone) conterrà differenti gruppi di frammenti di DNA se ci sarà un diverso stato di metilazione nei diversi campioni di DNA analizzati. Entrambi i prodotti di PCR per ogni gruppo di campioni, 'ampliconi pre trattati con MseI' e 'ampliconi pretrattati con MseI/BstUI', saranno utilizzati come sonde per lo screening di sequenze mutilate in maniera differenziale. I coloranti fluorescenti, Cys3 e Cys5 saranno accoppiati agli ampliconi per la marcatura e questi saranno co-ibridizzati al microarray messo a disposizione del gruppo dell'IGB. L'ibridazione ed i lavaggi post-ibridazione seguiranno le procedure standard. I risultati saranno analizzati come descritto precedentemente (36,37). I risultati ottenuti potranno poi essere confermati mediante 2 tecniche: 1) Sequenziamento dopo trattamento del DNA genomico con sodio bisulfito per l'analisi dei livelli di metilazione dei promotori e della posizione delle citosine metilate nei promotori dei geni identificati mediante DMH (36). 2) analisi mediante trasfezione di cellule con costrutti plasmidici di espressione in cui un gene "reporter" viene posto sotto il controllo di un promotore mutilato identificato da DMH (39).
4. Saggio di immunoprecipitazione della cromatina su chip, per l'identificazione del meccanismo di deregolazione genica nei pazienti iperomocisteinemici.
L'immunoprecipitazione della cromatina sarà effettuata usando sia anticorpi ottenuti commercialmente (istone H4 acetilato e iperacetilato, istone H3 acetilato; istone H3K9 e K4 di-trimetilato; MECP2-COOH; Upstate Biotechnology, Inc.) sia forniti da un collaboratore esterno, dr. M. Esteller, CNIO, Madrid.
La cromatina sarà preparata come descritto e il crosslink sarà fatto con la formaldeide. I complessi DNA-proteina saranno sonicati per ottenere frammenti tra i 200 e i 1000 bp, come determinato con elettroforesi su gel. Tutti i campioni saranno pre-purificati utilizzando la proteina A-Sepharosio. Dopo questo passaggio i campioni Ab+ saranno incubati con l'anticorpo MBD o/n a 4 °C e i complessi cromatina-anticorpo saranno eluiti e il DNA legato alle proteine sarà liberato con trattamento ad alta concentrazione salina a 65 °C. Tutti i campioni saranno trattati con proteinasi K e la frazione di DNA genomico ricca di MBD sarà estratta con la metodica fenolo-cloroformio con precipitazione in etanolo. Per i nostri esperimenti di ibridazione paragoneremo il grado di arricchimento in cromatina specificamente immunoprecipitata (ChIP) rispetto alla cromatina di partenza. Dopo la purificazione, i campioni saranno amplificati mediante ligation-mediated PCR e quindi marcati come descritto per DMH. Stesse quantità del campione e del corrispondente riferimento verranno miscelate e ibridate sullo stesso vetrino in un apparato dedicato (Amersham Biosciences). Gli esperimenti saranno condotti in triplicato. I dati ottenuti saranno analizzati come descritto prima per DMH. I risultati saranno normalizzati con controlli negativi e i risultati dell'ibridazione di campioni ottenuti in diverse condizioni saranno paragonati tra loro.

5. Identificazione di alterati profili di metilazione dei promotori dei singoli geni (recettore del folato, AdoHcy idrolisi, etc.). Trattamento con sodio bisulfito e analisi della sequenza di campioni di DNA di pazienti ESRD-ipertHcy e soggetti normali.
Mappa con sodio bisulfito. Nei casi in cui si possa ipotizzare la deregolazione dell'espressione di specifici geni-chiave, analizzeremo più dettagliatamente i livelli di metilazione delle isole CpG associate alle loro regioni promotrici. Per questo scopo saranno utilizzate sequenze genomiche dopo trattamento con sodio bisulfito, che converte le citosine non metilate in timine, permettendo così il riconoscimento di quelle metilate (5). Brevemente, DNA genomico verrà sottoposto a digestione a 37°C con un appropriato enzima di restrizione alla concentrazione di 5U/?g di DNA, seguita da precipitazione con 250mM NaCl e isopropanolo. 5?g di DNA digerito verranno trattati con sodio bisulfito come descritto (28). I prodotti di PCR verranno ottenuti con due reazioni di amplificazione, usando coppie di primer "nested". Tutti i prodotti di PCR verranno clonati nel vettore TOPO TA (Invitrogen). Circa 60 cloni (30 per ogni allele) saranno isolati per ogni paziente e sequenziati (28). Lo stato di metilazione dei singoli siti CpG sarà determinato comparando le sequenze ottenute con sequenze di geni noti. Il sequenziamento sarà effettuato con un sequenziatore automatico ABI, Applied Biosistema, Foster City, CA, USA.

6. Analisi epigenetica di singoli geni deregolati in pazienti iperomocisteinemici.
In questa parte del progetto ci proponiamo di confermare e analizzare dettagliatamente le alterazioni delle caratteristiche epigenetiche di geni specifici in pazienti iperomocisteinemici con modificazioni istoniche, cambiamenti nella struttura della cromatina e espressione di una sottopopolazione di geni negli stessi campioni. Questo ci potrebbe aiutare nel definire una serie di marcatori molecolari di disfunzione cardiiovascolare nell' iperomocisteinemia. Le modificazioni della cromatina saranno analizzati, nei campioni sopra menzionati e in individui normali, usando il saggio di immunoprecipitazione della cromatina ( ChIP assay; 40). Anticorpi contro gli istoni modificati sono in parte disponibili in commercio e in parte ci saranno forniti da collaboratori esterni, come pure i reagenti peer analizzare il legame e la regolazione di tale legame delle proteine leganti il DNA metilato (MBDs)(vedi sopra). Cambiamenti dell'espressione genica saranno valutati attraverso PCR in tempo reale

I risultati attesi includono l'identificazione e caratterizzazione di nuovi markers molecolari per
a) Una migliore comprensione del meccanismo di tossicità dell'Hcy,
b) Una possibile più adeguata valutazione del profilo di rischio cardiovascolare nei pazienti iperomocisteinemici.