RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Cause, conseguenze, e aspetti terapeutici dell'iperomocisteinemia nell'uremia e nel diabete.

Università di riferimento

Università degli Studi di PADOVA - MEDICINA CLINICA E SPERIMENTALE - PADOVA(PD)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Paolo TESSARI

Descrizione

Il programma di ricerca si propone di studiare la cinetica in vivo della metionina e dell'omocisteina in pazienti con diabete mellito di tipo 2 ed insufficienza renale avanzata o preterminale (in stadio 3). La cinetica di metionina ed omocisteina verrà inoltre determinata in un gruppo di pazienti dopo trapianto di rene, per verificare l'effetto della ripresa della funzionalità renale sulle vie metaboliche dell'omocisteina. Tale gruppo potrà essere rappresentato dagli stessi pazienti già studiati prima del trapianto, ove fosse possibile. Lo studio verrà eseguito sia in condizioni basali che in corso di iperinsulinemia. Le tappe metaboliche del metabolismo di metionina ed omocisteina verrnno indagate in vivo mediante l'uso di isotopi stabili della metionina.

Lo studio si propone quindi di:

1. misurare la cinetica in vivo di metionina ed omocisteina in pazienti con diabete di tipo 2 con insufficienza renale terminale predialitica, in condizioni basali.
2. valutare l'effetto dell'iperinsulinemia su tali tappe metaboliche.
3. studiare l'effetto del trapianto di rene nelle stesse condizioni sperimentali, cioè in condizioni basali e in corso di iperinsulinemia.

Tali obbiettivi verranno perseguiti utilizzando metodiche di Spettrometria di Massa associata all'infusione isotopi stabili.


SELEZIONE DELLA CASISTICA.

Verranno reclutati 6-8 pazienti diabetici di tipo 2, di sesso maschile, di età compresa tra i 40 e i 65 anni, non obesi, con nefropatia diabetica ed insufficienza renale avanzata in stadio 3 (con filtrato glomerulare di 20-30 ml/min). I pazienti dovranno essere in condizioni metaboliche e cardiocircolatorie stabili. Verranno altresì reclutati 6-8 pazienti con diabete di tipo 2 e sottoposti a trapianto di rene, in condizioni generali e cardiocircolatorie stabili. I pazienti verranno studiati nel corso della loro usuale terapia immunosoppressiva. Eventuali farmaci ipoglicemizzanti verranno sospesi al mattino dello studio.


METODI SPERIMENTALI

Tutti i soggetti verranno invitati a seguire un regime dietetico costante per almeno un mese, con un contenuto calorico consistente per il 50% di carboidrati, per il 20% di proteine e per il 30% di lipidi. L'assunzione proteica giornaliera dovrà risultare almeno di 1 grammo di proteine/Kg di peso corpore. A tutti i soggetti verrà raccomandato di sospendere ogni trattamento farmacologico la sera prima dello studio. La velocità di filtrazione glomerulare sarà espressa come clearance della creatinina. L'escrezione urinaria dell'albumina sarà misurata in almeno due campioni di urine raccolte nelle 12 ore.
Tutti i partecipanti allo studio firmeranno un consenso informato dopo aver ricevuto tutte le informazioni riguardanti lo scopo e le modalità d'esecuzione dello stesso. Il protocollo verrà sottoposto per approvazione al Comitato Etico della Facoltà di Medicina, Università di Padova, Italia, e sarà condotto in accordo con la Dichiarazione di Helsinki (revisionata nel 1983).

DISEGNO SPERIMENTALE
Tutti i soggetti dello studio si presenteranno presso il Dipartimento di Medicina Clinica e Sperimentale, Divisione di Malattie del Metabolismo, alle ore 7 del mattino il giorno dello studio, in condizioni di digiuno dalla sera precedente. Nella vena antecubitale del braccio destro sarà posizionata un'agocannula di 18 gauge di polietilene per l'infusione di insulina, soluzione glucosata e isotopi. La vena del polso del braccio controlaterale sarà incannulata in via retrograda per i prelievi di sangue venoso arterializzato da eseguire durante lo studio, con la mano introdotta in un box termico riscaldato a 55°C.
Lo studio verrà diviso in due sezioni sperimentali: un periodo basale e un successivo periodo di clamp euglicemico-iperinsulinemico. Dopo i prelievi basali di sangue e di aria espirata necessari per la determinazione degli arricchimenti isotopici naturali, alle ore 08:00 (tempo -180 min), verrà iniziata l' infusione di L- [1-13C, methyl-D3]-metionina (alla velocità di 0.6-0.8 mg/kg x ora). L' infusione continua verrà preceduta da una dose "priming", pari a 45 volte l'infusione continua in un'ora. Gli isotopi stabili verranno acquistati come preparati dichiarati sterili e apirogeni, e verranno diluiti opportunamente in soluzione salina in condizioni di sterilità. Gli isotopi verranno successivamente testati per sterilità e apirogenicità presso laboratori autorizzati, e ne verrà fornita la documentazione relativa. Campioni di sangue venoso arterializzato saranno prelevati ogni 30 minuti per 120 minuti, per la valutazione del raggiungimento dello stato stazionario. Tra il 120' e il 180' minuto, verranno prelevati altri tre-quattro campioni di sangue e di aria espirata, per le misurazioni nel periodo basale dell'arricchimento isotopico, delle concentrazioni di substrati e di ormoni nel plasma, e dell'arricchimento in 13CO2 nell'aria espirata. L'aria espirata sarà raccolta usando una valvola a tre vie in un sacchetto di plastica contenente provette di vetro vuote, prive di silicone. che verranno rapidamente tappate prima di essere rimosse dal sacchetto. Tra il 90' e 120' minuto la produzione totale di CO2 prodotta sarà determinata mediante un calorimetro (Deltatrac, Datex Italia, Milano, Italia).
Successivamente, verrà iniziato il clamp euglicemico iperinsulinemico. Insulina rapida (Humulin R, Eli-Lilly, Indianapolis, USA) viene diluita in soluzione salina con l'aggiunta di 2 ml di sangue di ciascun soggetto e viene infusa alla velocità di 1.9 mU/kg x min-1 per 180 minuti. Nei primi 10 minuti, la velocità d'infusione dell'insulina viene raddoppiata allo scopo di saturare rapidamente il pool circolante dell'insulina. L'euglicemia (tra 85 e 90 mg/dl) verrà mantenuta con l'infusione del destrosio esogeno al 20%. Il destrosio infuso deriva dall'amido di mais. La concentrazione plasmatica di glucosio verrà monitorata ogni 10 minuti con l'uso di due reflettometri, frequentemente calibrati (Beckman Glucose Analyzer 2, Beckman Instruments, Fullerton, CA, USA). Dopo 120' minuto dall'inizio dell'infusione insulinica, 3-4 prelievi di sangue ed aria espirata verranno nuovamente eseguiti per altri 60 minuti per le misurazioni al nuovo stato stazionario. Tra il 160' e 180' minuto, la produzione totale di CO2 totale prodotta sarà di nuovo misurata usando il calorimetro.

STUDI DI CONTROLLO
Poiché il glucosio infuso, derivante dall'amido di mais, può essere naturalmente arricchito in 13C a valori superiori a quelli preesistenti nell'organismo umano in condizioni di base, l'arricchimento nella 13CO2 espirata durante il periodo di clamp potrebbe essere artificialmente aumentato a causa del contributo dell'ossidazione del glucosio infuso sulla produzione totale di CO2. Come controllo per questo potenziale bias, sono stati eseguiti studi di controllo in quattro soggetti di normali. In tali soggetti, la quota di 13CO2 espirata è stata misurata durante clamp euglicemico-insulinemico (quindi in corso di infusione ev. di glucosio esogeno, senza l'infusione di metionina marcata) nelle stesse condizioni sperimentali. In tal modo, è stato calcolato un fattore di correzione per la quantità di 13CO2 espirata derivata dal glucosio infuso, quantità che è stata sottratta alla produzione totale di 13CO2 espirata durante gli studi con l'infusione del tracciante.

ANALISI BIOCHIMICHE
Dopo il prelievo, 4-5 ml di sangue sono immediatamente raccolti all'interno di provette raffreddati contenenti EDTA (6% w/vol), e depositati all'interno di un contenitore di ghiaccio. Il plasma è separato tramite la centrifugazione entro circa 1 ora.
L'arricchimento plasmatico della metionina nei due tipi di isotopi contenuti nella molecola, il [metil–2H3, 1-13C] (M+4) e il [1-13C] (M+1), è misurato mediante gas cromatografia spettrometria di massa (GCMS) (utilizzando uno strumento Agilent, mod. 5790, Palo Alto CA, USA) come tert-butil-dimetil-silil derivati, utilizzando la ionizzazione ad impatto elettronico, e monitorando i frammenti (m/z)[324/320] e (m/z) [321/320] rispettivamente (14). L'arricchimento plasmatico dell'omocisteina è misurato mediante GCMS utilizzando un metodo recentemente sviluppato nel nostro laboratorio (15). I coefficienti di variazione intra- ed inter- assay sono del 1.5% e 1.8%, rispettivamente. L'arricchimento in 13CO2 nell'aria espirata è determinato usando un strumento GC-IRMS (gas cromatografia spettrometria di massa a rapporto isotopico). Gli arricchimenti sono espressi come rapporto tra tracciante e tracciato (TTR) (16). Le concentrazioni plasmatiche dell'insulina sono misurate con metodo RIA. La concentrazione plasmatica di omocisteina è misurata mediante FPIA (Abbott, Abbott Park, Ill, USA). Le concentrazioni plasmatiche degli aminoacidi sono misurate mediante cromatografia a scambio cationico, usando un analizzatore per aminoacidi Beckman.

METODI DI CALCOLO

Verrà calcolata la media dei valori degli arricchimenti plasmatici di metionina, nei due periodi dello stato stazionario, ovvero negli ultimi 60 min dello stato basale, e negli ultimi 60 min al termine del clamp insulinico (ovvero tra il 120' e il 180' minuto). Tutti i calcoli sono eseguiti usando questi valori medi.
La cinetica plasmatica della metionina è calcolata usando il modello di Storch et al. senza alcuna correzione per l'arricchimento plasmatico della metionina, ma esteso all'uso dell'arricchimento plasmatico dell'omocisteina per calcolare le cinetiche intracellulare.

Le equazioni del modello sono riportate qui sotto:

Eq. 1: Qm = Itr x (Etr/E4 – 1)

e:

Eq. 2: Qc = Itr x (Etr/(E1 + E4) - 1)

dove: Qm and Qc sono le velocità di comparsa della metionina nel plasma utilizzando o le masse (M+4) o quelle (M+1); [Itr] è la velocità di infusione del tracciante (in µmol/kg x ora-1); [Etr] è l'arricchimento del tracciante; e [E4] e [E1] sono gli arricchimenti plasmatici di [methyl-2H3, 1-13C] (m+4), e di [1-13C] (m+1) rispettivamente. La massa (M+1) è generatat dalla demetilazione del tracciante doppiamente marcato [methyl-2H3, 1-13C] a causa della perdita irreversibile del gruppo [methyl-2H3] nel pool intracellulare dei metili. L'arricchimento totale di [1-13C] (m+1) è la somma degli arricchimenti degli isotopi [1-13C] (m+1) e [methyl-2H3, 1-13C] (m+4), poichè ambedue contengono il carbonio 13C.

La velocità di remetilazione dell'Hcy è calcolata come :

Eq. 3: RM = Qm - Qc

La velocità di perdita irreversibile di Hcy nella transsulfurazione è assunta eguale alla velocità di ossidazione. Perciò, la ossidazione della metionina è calcolata dividendo la velocità di produzione della 13CO2 (in µmoli/kg x ora-1) (corretta per il 20% di fissazione nel pool corporeo del bicarbonato), sull'arricchimento (TTR) plasmatico totale di 13C-metionina, cioà la somma delle masse (M+4) e (M+1):

Eq. 4: TS = V 13CO2 x (1/[13C]Met Epl – [1/13C] Met Etr)

dove: [V13CO2] è la velocità di espirazione di 13CO2 (in moli/kg x ora-1), a sua volta calcolata moltiplicando l' atom % excess della 13CO2 espirata, convertita in micromoli e corretta per la fissazione del bicarbonato, per la produzione totale di CO2 (VCO2) (in ml/kg x ora); e [13C]Met Epl è l'arricchimento totale di [13C]-metionina nel plasma, cioè la somma delle masse (M+4) e (M+1. TS è pure corretta per il contributo del glucosio infuso all'ossidazione e produzione di CO2 durante il clamp.

La velocità di transmetilazione della metionina (TM) è calcolata come segue:

Eq. 5: TM = RM+TS

La velocità del metabolismo non ossidativo della metionina, cioè l'indice di incorporazione nelle proteine, verrà calcolato sottraendo TS from Qc.

Eq. 6: PS = Qc - TS

Infine, la clearance della Hcy verrà calcolata dividendo la somma della rimozione della Hcy per RM e TS per la sua concentrazione:

Eq. 7: [RM + TS] / [Hcy]

ove [Hcy] è la concentrazione plasmatica della Hcy(in µmol/l).
In aggiunta alle cinetiche plasmatiche sopra descritte, le cinetiche intracellulari di metionina ed omocisteina vengono calcolate utilizzando un modello pubblicato recentemente, che si basa sull'uso dell'arricchimento plasmatico di 13C-omocisteina come pool precursore, in analogia con il sistema di leucina/alfa-ketoisocaproato.


ANALISI STATISTICA DEI DATI
Tutti i risultati saranno espressi come media±SEM. Per le misurazioni ripetute è utilizzato il test statistico ANOVA a due vie, per paragonare i dati del periodo basale e del periodo di clamp tra i soggetti diabetici e i soggetti di controllo. Verrà utilizzato il test T-Student a due code per dati appaiati dove specificatamente indicato, per paragonare i valori all'interno dei due gruppi tra il periodo basale ed i clamp. Il test T-Student a due code per dati non appaiati è usato anche per paragonare due gruppi di dati singoli (cambiamenti relativi rispetto ai valori basali, prima e dopo clamp tra i due gruppi). Le analisi sono eseguite sulla trasformazione logaritmica dei dati quando la loro distribuzione non risulta di modalità normale. L'analisi di regressione è eseguita usando la regressione lineare semplice. Il programma utilizzato sarà lo Statistica Software (Version 6, StatSoft, Tulsa, OK, USA). Un valore di p minore di 0.05 è considerato statisticamente significativo.

Riassumendo, i dati di cinetica che verranno misurati sono i seguenti:

a. Produzione di metionina;
b. Transmetilazione ed incorporazione in proteine della metionina; remetilazione, transulfurazione e clearance dell'omocisteina;
c. Effetti dell'iperinsulinemia sui parametri di cui ai punti a. e b.
d. Indice di insulino-sensitività per l'utilizzazione del glucosio.


RISULTATI ATTESI

Lo studio valuterà il metabolismo della metionina e dell'omocisteina in pazienti con insufficienza renale pre-terminale e l'effetto sul metabolismo degli aminoacidi solforari del trapianto di rene. Lo studio è l'integrazione e la prosecuzione di un protocollo già effettuato, che ha permesso di valutare le vie metaboliche della produzione e della utilizzazione di metionina e di omocisteina nel diabete mellito con nefropatia iniziale. Tale studio ha permesso di evidenziare un deficit di rimozione dal circolo di omocisteina come meccanismo patogenetico dell'iperomocisteinemia in tali pazienti. Inoltre, ha potuto dimostrare come l'effetto dell'insulina sulla stimolazione delle vie metaboliche della transmetilazione della metionina e dell'utilizzo ossidativo dell'omocisteina siano alterate nel diabete mellito con nefropatia iniziale. Poiché il rene è sede importante di catabolismo della omocisteina, è probabile sia che tali difetti siano ulteriormente accentuati nell'insufficienza renale preterminale, e che il trapianto di rene abbia un effetto di miglioramento di tali vie, risultando in una riduzione dell'iperomocisteinemia.
Inoltre, poichè l'insulina stimola transmetilazione e transsulfurazione, la presenza di una condizione di insulino resistenza nel diabete di tipo 2, eventualmente accentuata dall'insufficienza renale, verrò misurata con le metodiche applicate.

L'impiego di moderne metodologie di studio metabolico in vivo permetterà l'analisi in dettaglio della velocità di rilascio in circolo di metionina e di omocisteina, di transmetilazione della metionina ad omocisteina, di remetilazione dell'omocisteina a metionina, e della transsulfurazione dell'omocisteina a cistatiinina. Verranno utilizzate metodiche non invasive che prevedono l'uso di isotopi stabili ed analisi nel plasma mediante spettrometria di massa. Tale approccio ha già fornito risultati qualitativi ed originali per quanto riguarda l'effetto dell'insulina nel soggetto normale, e il confronto tra normali e diabetici con insufficienza renale iniziale.