RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Targeting molecolare e sviluppo di un nuovo approccio alla terapia radiorecettoriale del carcinoma tiroideo di derivazione dall'epitelio follicolare non iodocaptante.

Università di riferimento

Università degli Studi di FIRENZE - CHIMICA ORGANICA - FIRENZE(FI)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Mauro GINANNESCHI

Descrizione

Gli obbiettivi della nostra unità di ricerca sono: a) ottenimento di nuovi analoghi dell'octreotide; b) preparazione di nuovi chelanti azamacrocicli per la chelazione dello ione Cu(II), ottenibili via sintesi peptidica in fase solida (SPPS); c) sintesi di nuovi derivati della biotina coniugati con chelanti adatti al trasporto di radionuclidi. Le vie sintetiche migliori saranno realizzate dopo un accurato studio di progettazione molecolare per la scelta delle strutture più adatte ad esprimere le proprietà chimico-fisiche e biologiche richieste. Nella prima fase del programma, l'unità di Firenze metterà a disposizione degli altri laboratori afferenti al progetto o che comunque collaborano alla ricerca i nuovi analoghi della Somatostatina ed i nuovi macrocicli, già preparati od in avanzata fase di realizzazione, per gli studi chimico fisici, biologici, farmaco-clinici e di marcatura con radioisotopi. Di seguito, l'unità realizzerà le nuove molecole attualmente in fase di progettazione. Qui sotto vengono specificati i risultati fin qui conseguiti nelle tre linee tematiche in cui è divisa la ricerca e gli sviluppi prevedibili nell'ambito del progetto.
Linea di ricerca n. 1. Analoghi della Somatostatina. E' stato recentemene preparato nei nostri laboratori un analogo dell'octreotide, tramite una reazione di ring closing metathesis (RCM) in fase solida, effettuata sull'octapeptide lineare contenente due residui di allil glicina al posto delle corrispondenti cisteine. La reazione ha condotto ad un dicarba-analogo insaturo dell'octreotide, che mantiene la stessa sequenza dei residui ammino acidici ma non presenta il ponte disolfuro proprio della sandostatina, che era un punto di attacco per agenti riducenti endogeni (ad esempio la glutatione ossidasi e la tioredossina reduttasi) ed ossidanti esogeni, nonché per agenti basici e nucleofili[1]. Inoltre il ponte disolfuro rende complicata la marcatura con radioisotopi quali ^99mTc e ¹⁸⁸Re [2].
Come ci attendevamo, la presenza del doppio legame ha reso più rigido il ciclo ed ha permesso di mantenere la conformazione turn di tipo II' della sequenza farmacofora; ciò è stato dimostrato da studi delle interazioni NOE in soluzione acquosa, effettuati tramite spettroscopia NMR ad alto campo, e dalla successiva analisi conformazionale. Le indagini sono state eseguite presso il Dip. di Scienze Farmaceutiche e Tossicologiche dell'Università di Napoli. La sostanza ha mostrato inoltre una grande stabilita in siero umano. Lo studio relativo verrà pubblicato su Letters in Organic Chemistry a Maggio 2005 [3]. Sia questa molecola sia il prodotto ottenuto per riduzione del doppio legame etilenico (comunicazione al 28^th European Peptide Symposium) [4] così come altri analoghi modificati di questo tipo sono coperti da un nostro brevetto [5]. Stiamo studiando la conformazione dell'analogo ridotto, contenente il ponte -(CH₂)₄-, che sembra però possedere analoga conformazione di turn a livello della sequenza farmacofora. Questa tecnica sintetica potrà venire utilizzata anche per la trasformazione del ponte disolfuro di altre due molecole utilizzate nella pratica clinica, sia pure meno frequentemente: il lanreotide ed il vapreotide. Tutti i nuovi composti verranno studiati riguardo alla loro affinità di binding con i recettori della somatostatina ed alla loro eventuale azione su linee di cellule tumorali. Questi esperimenti verranno eseguiti presso le altre unità del progetto equipaggate in tal senso. Tuttavia studi di proteomica potranno venire eseguiti anche presso questa unità, dotatasi di recente di un moderno strumento di massa (Waters Q-Tof Premier Mass Spectrometer) specialmente adatto a tale scopo. La struttura di questo analogo si presta però anche a numerose modifiche funzionali con lo scopo di sostituire gradualmente il backbone peptidico con opportuni scaffolds peptido-mimetici. Ad esempio, Hirschman e coll. hanno recentemente sintetizzato peptido-mimetici della somatostatina costituiti da scaffolds zuccherini, con catene laterali che mimano parte del farmacoforo dell'octreotide. Queste molecole sono risultate assai attive in vitro nei confronti del recettore hsst₄ [6]. Kessler e coll. hanno costruito uno pseudo-cicloesapeptide contenente un carboidrato a struttura furanosica che ha mostrato proprietà antimitotiche ed apoptotiche, in vitro [7]. Questi risultati suggeriscono che sintetizzando opportuni building blocks zuccherini ed inserendoli nella catena peptidica dei nostri analoghi potremmo ottenere strutture peptido-mimetiche altamente costrette dal punto di vista conformazionale, con aumentata affinità recettoriale e stabilità enzimatica. Le molecole verranno realizzate solo dopo un'attenta analisi conformazionale computerizzata, eseguita da questa unità, per valutare se le modificazioni che si vogliono apportare influenzano, ed eventualmente in quale modo, la geometria dei derivati e la disposizione del farmacoforo. Sarà utilizzato il software della Accelrys (San Diego): Insight II, per il disegno delle molecole come input per i programmi di calcolo ed il display dei risultati, e Discover per le minimizzazioni e le dinamiche molecolari. Lo studio conformazionale verrà eseguito utilizzando sia una ricerca sistematica, per le posizioni delle catene laterali, sia il simulated annealing per le conformazioni del ciclo. Il software è implementato su una Silicon Graphics O2 R12000. Eventuali calcoli ab initio o semiempirici verranno effettuati con Spartan'04 (Wavefunction Inc., 18401 Von Karman Avenue, Suite 370, Irvine, CA92612). I dati conformazionali calcolati verranno poi confrontati con i dati sperimentali derivanti da una analisi NMR, effettuata da ricercatori afferenti al dipartimento di Chimica Farmaceutica e Tossicologica dell'Università di Napoli. L'analisi conformazionale verrà eseguita per mezzo di calcoli di dinamica molecolare ad alta temperatura seguiti da uno o più cicli di dinamica molecolare ristretta e minimizzazione; le costrizioni saranno ottenute utilizzando calibrazioni delle distanze (r^-6, approssimazione dei due spin) per convertire le più intense e significative interazioni dipolari raccolte negli spettri NMR. Tutti gli spettri NMR necessari per l'elaborazione delle strutture (1H, HMBC, HSQC, TOCSY, COSY, ROESY, NOESY) saranno registrati su di un apparecchio VARIAN INOVA-UNITY 700. I dati NMR saranno elaborati su di una stazione di calcolo Silicon Graphic OCTANE2, usando il software NMRPIPE, XEASY ed InsightII. Seguendo lo stesso metodo di progettazione sarà possibile modificare la sequenza peptidica per diversificare l'affinità recetoriale: ad esempio, i dati di letteratura suggeriscono che il DOTA-1-Nal³-octreotide (DOTA-NOC) ha alta affinità verso hsst₂ ma anche aumentata affinità verso i sottotipi hsst₃ ed hsst₅ risultando, dunque, una promettente molecola per la diagnosi e terapia di alcuni tumori tiroidei [8]. La struttura del ponte a 4C potrebbe, inoltre, essere modificata introducendovi catene laterali di tipo basico che sembra abbiano molta importanza per l'affinità verso i recettori hsst_1,3,5 [9]. Anche la lunghezza del ponte carbonioso potrà essere modificata, inserendo nella sequenza alchenil glicine con catene laterali a più alto numero di atomi di C, per regolare la flessibilità dell'intero anello. Lo scopo finale delle modifiche è quello di ottenere analoghi con un largo spettro di affinità verso i vari sottotipi recettoriali.
Linea di ricerca n. 2. Leganti azamacrociclici. Nei nostri laboratori è stata, recentemente, messa a punto la sintesi di ciclopeptidi costretti, tramite un metodo di sintesi innovativa su fase solida, cioè ancorando ad un'opportuna resina la catena laterale di uno degli amminoacidi della sequenza peptidica ed utilizzando il principio della pseudo-diluizione. Nel caso di ciclopeptidi contenti istidina il metodo migliore di sintesi in fase solida è stato quello di ancorare l'anello imidazolico, opportunamente protetto, ad una resina tritile, effettuando i successivi accoppiamenti con la strategia di protezione ortogonale Fmoc/tBu/OAl. Questo nuovo procedimento di sintesi ci ha permesso di preparare rapidamente e con buone rese peptidi costretti come quelli riportati in figura, altrimenti ottenibili con difficoltà utilizzando i metodi classici di ciclizzazione [10]. Come si può constatare dall'esame delle strutture, i ciclopeptidi ottenuti sono ricchi di istidina, un amminoacido quasi sempre presente nei siti delle proteine naturali che complessano lo ione Cu(II). La coordinazione di Cu(II) con peptidi lineari e ciclici contenenti istidina è da tempo oggetto dei nostri studi [11]. Oltre alle dimensioni del ciclo, anche le funzionalità presenti sulle catene laterali possono essere facilmente modificate per questa via inserendo nella sequenza gli amminoacidi opportuni.

Dal ciclotetrapeptide cHGHG su fase solida abbiamo ottenuto, per riduzione con BH₃.THF, il corrispondente tetraazamacrociclo [12].

Di seguito sono stati sintetizzati gli analoghi ciclotetrapeptidi sostituendo un residuo di Gly con uno di Lys, di Asp o di Glu e, per riduzione del ciclopeptide ancorato alla resina, abbiamo ottenuto i relativi tetraazamacrocicli C-sostituiti, sia pure con rese finora assai basse, aprendo così una nuova via di sintesi rapida e flessibile per ottenere leganti di questo tipo. Sono in corso ricerche tendenti a migliorare in modo consistente le rese in azamacrocicli ottenibili dalla reazione di riduzione del legame peptidico, sia modificando gli agenti riducenti sia utilizzando resine diverse. Inoltre, gli studi chimico-fisici e di modellistica compiuti presso l'unità di Siena indicheranno le migliori sequenze peptidiche atte a migliorare la solubilità in acqua e la capacità di coordinazione di queste sostanze. Utilizzando gli opportuni amminoacidi naturali o sintetici dovranno essere progettati e realizzati azamacrocicli di dimensioni maggiori (vedi scheletro del cyclam) o con bracci laterali di lunghezza ed orientazione opportuna per la complessazione del metallo; i gruppi chelanti laterali potranno essere diversi dall'imidazolo, pur mantenendo la struttura di questi composti al livello di BCFAs capaci di legarsi a carriers quali antigeni peptidici od altri (ad esempio i derivati della biotina). Proteggendo gli atomi di azoto degli anelli imidazolici con metodi già noti in letteratura, sarà possibile introdurre gruppi funzionali anche sugli atomi di azoto del macrociclo. Con l'appoggio delle unità italiane partecipanti al progetto e dei gruppi di ricerca stranieri con cui collaboriamo (Prof. Henryk Kozlowski, Dip. di Scienze Mediche di Base, Università Medica di Wroclaw, Polonia) contiamo di determinare le costanti di stabilità e la struttura dei vari composti di coordinazione con lo ione Cu(II). Questi studi serviranno a chiarire la stabilità dei complessi a pH fisiologico e la cinetica di scambio con altri chelanti naturali o sintetici. In caso di riscontro positivo, i laboratori attrezzati che partecipano al progetto, in specie i gruppi di ricerca che operano presso la Divisione di Medicina Nucleare della Facoltà di Medicina e Chirurgia dell'Università di Pisa e dell'Istituto Europeo di Oncologia (IEO), si occuperanno della marcatura dei nuovi leganti con il radioisotopo ⁶⁴Cu nonché delle prove di stabilità in vitro ed in vivo dei composti di coordinazione. Ci proponiamo, tuttavia, di utilizzare in seguito anche isotopi differenti, in particolare ¹¹¹In, ⁹⁰Y e ¹⁸⁸Re.
Linea di ricerca n. 3. Derivati della biotina per il protocollo di targeting Avidina/biotina. Abbiamo iniziato da tempo una collaborazione con IEO riguardante la sintesi di nuovi derivati della biotina, coniugati con chelanti macrociclici, ad esempio il gruppo DOTA e dotati di elevata affinità di binding con Av o Sav, al fine di ottenere molecole marcate con ioni ¹¹¹In od ⁹⁰Y ed atte ad essere impiegate nella diagnosi e terapia dei tumori utilizzando il protocollo così detto del pre-targeting. Abbiamo realizzato la struttura riportata in figura attraverso la riduzione della corrispondente N-amminoalchil ammide, prima della coniugazione con la molecola di DOTA. Il composto ottenuto, essendo privo del legame ammidico, si è dimostrato resistente all'azione della biotinidasi e dotato di una buona affinità per l'Avidina

I primi test in vitro hanno indicato che questa sostanza è un buon candidato per soddisfare gli scopi clinici che ci eravamo prefissi [13]. Le ricerche proseguiranno modificando questa molecola con l'intento di migliorare ancora l'affinità di binding del radiofarmaco con la proteina Avidina, portandola a livelli comparabili con quella della Vitamina H naturale. Questo risultato potrebbe essere raggiunto funzionalizzando il gruppo amminico secondario in modo tale da incrementare il numero e la forza dei legami ad idrogeno con le catene laterali dei siti di legame dell'Avidina. Suggerimenti in questo senso sono stati forniti da un gruppo di ricerca del Wolfson Centre for Applied Structural Biology, Università di Gerusalemme che studia, attraverso le strutture ai raggi X, le interazioni di legame fra biotine modificate ed amminoacidi presenti nelle quattro tasche dell'Avidina deputate al binding. Contemporaneamente, sono già in fase di avanzata realizzazione derivati della biotina che possono portare due gruppi chelanti allo stesso tempo, per incrementare il rapporto radiazione/dose.
Articolazione della ricerca: 1) sintesi delle molecole già progettate e solo in parte realizzate; progettazione e realizzazione delle nuove molecole; 2) studi conformazionali sui nuovi analoghi della Somatostatina; studi di complessazione sui nuovi leganti.
Bibliografia:
[1] R. M. Willliams and J. Liu, J. Org. Chem., 1998, 63, 2130-2132.
[2] J. Fichna, A. Janecka, Bioconj. Chem, 2003, 14, 3-17.
[3] A. Carotenuto, D. D'Addona, E. Rivalta, M. Chelli, A. M. Papini, P. Rovero, and M. Ginanneschi, Lett. Org. Chem., 2005, in corso di stampa.
[4] D. D'Addona, M. Chelli, A. M. Papini, F. Bucelli, A. Carotenuto, M. Ginanneschi, Journal of Peptide Science, 2004, 10(8), P17, pag. 125.
[5] Mauro Ginanneschi, Mauro Giuntini, Mario Chelli, Anna Maria Papini, IT Pat.Appl.n.FI2004A000057, EP Pat. Appl. n. 05101866.1.
[6] V. Prasad, E. T. Birzin, C. T. McVaugh, R. D. van Rijn, S. P. Rohrer, G. Chicchi, D. J. Underwood, E. R. Thorton, A. B. Smith, III, and R. Hirschmann, J. Med. Chem., 2003, 46, 1858-1869.
[7] S. A. W. Gruner, G. Kéry, R. Schwab, A. Venetianer, and H. Kessler, Org. Letters, 2001, 3(23), 3723-3725.
[8] J. J. M. Teunissen, D. J. Kwekkeboom, P. P. M. Kooij, W. H. Bakker, and E. P. Krenning, J. Nucl. Med. , 2005, 46, 107-114.
[9] I. Lewis , W. Bauer, R. Albert, N. Chandramouli, J. Pless, G. Weckbecker, and C. Bruns, J. Med. Chem., 2003, 46, 2334-2344.
[10] M. C. Alcaro, G. Sabatino, J. Uziel, M. Chelli, M. Ginanneschi, P. Rovero, A. M. Papini, J. Peptid. Science, 2004, 10, 218-228.
[11] M. Casolaro, M. Chelli, M. Ginanneschi, F. Laschi, L. Messori, M. Muniz-Miranda, A. M. Papini, T. Kowalik-Jancowska, H. Kozlowski, J. Inorg. Biochem., 2002, 89, 181-190; M. Orfei, M. C. Alcaro, G. Marcon, M. Chelli, M. Ginanneschi, H. Kozlowski, J. Brasun, L. Messori, J.Inorg. Biochem., 2003, 97, 299-307;J. Brasun, C. Gabbiani, M. Ginanneschi, L. Messori, M. Orfei, J. Swiatek-Kozlowka, J. Inorg. Biochem., 2004, 98, 2016-2021.
[12] M. C. Alcaro, M. Orfei, M. Chelli, M. Ginanneschi and A. M. Papini, Tetrahedron Lett., 2003, 44, 5217-5219.
[13] Marco Chinol, Giovanni Paganelli, Mauro Ginanneschi, PCT Int. Appl 2002, WO 02/066075, Kind A2, Appl. No. PCT/IT02/00091, Priority RM01A000079, 16.02.2001; G. Sabatino, M. Chinol, G. Paganelli, S. Papi, M. Chelli, G. Leone, A. M. Papini, A. De Luca, and M. Ginanneschi, J. Med. Chem, 2003, 46, 3170-3173.