RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Meccanismi di suscettibilità e di attivazione delle risposte tissutali e cellulari indotte dall'antigene nell'asma

Università di riferimento

Università degli Studi di CATANIA - MEDICINA INTERNA E MEDICINA SPECIALISTICA - CATANIA(CT)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Giuseppe DI MARIA

Descrizione

La nostra Unità si occuperà di studiare l'andamento di alcuni mediatori dell'infiammazione nell'asma atopico e non atopico durante la fase stabile e in corso esacerbazione. I mediatori verranno valutati attraverso tecniche non invasive quali lo sputo indotto, il condensato del respiro esalato e la misurazione dell'ossido di azoto nell'aria esalata.
Saranno reclutati in tutto 60 pazienti con asma lieve-moderato, 30 atopici e 30 non atopici, e 20 soggetti di controllo, sani, non fumatori, appaiati per sesso e per età . Tutti i pazienti verranno studiati durante la fase di riacutizzazione dell'asma e dopo 4 settimane dalla stabilità clinica. La diagnosi di asma allergico/non allergico e dello stato di riacutizzazione sarà posta o documentata attraverso la storia clinica, gli esami funzionali (spirometria) il prick-test con aeroallergeni secondo le raccomandazioni delle linee guida GINA. Saranno esclusi dallo studio i pazienti fumatori, affetti da altre malattie respiratorie o malattie croniche. Saranno esclusi inoltre i pazienti che giungono alla nostra osservazione già in trattamento con steroidi sistemici.

Nel primo e nel secondo giorno di studio saranno effettuati i seguenti test:

a) Raccolta del condensato del respiro esalato
In breve, i soggetti dovranno respirare a volume corrente per circa 15 minuti attraverso un sistema che permette il raffreddamento e la condensa dell'esalato (Ecoscreen, Jager, Hoechberg, Germany). Con questo sistema si ottengono circa 1.5-2 ml di condensato che sarà suddiviso in aliquote prima di essere conservato a –80 °C.

b) Misurazione dell'ossido nitrico
L'NO nell'aria esalato viene misurato con una manovra standard attraverso la tecnica della chemiluminescenza, Verranno effettuate tre misurazioni a distanza di un minuto dalle quali si otterrà una media finale.

c) Raccolta dello sputo indotto
Dopo avere ottenuto una spirometria di base secondo le raccomandazioni dell'American Thoracic Society e inalato 200 µg di salbutamolo per prevenire la broncocostrizione, i pazienti inaleranno per un periodo di 7 minuti un aerosol di soluzione salina ipertonica generato da un nebulizzatore ultrasonico. Alla fine di questo periodo verrà effettuata una seconda spirometria e se la variazione del FEV1 rispetto al valore basale non sarà superiore al 10% si procederà con la raccolta dello sputo indotto.
L'espettorato raccolto verrà processato entro due ore, per garantire una corretta valutazione della cellularità e la colorazione. Data la particolare viscosità delle secrezioni bronchiali si effettuerà la fluidificazione dell'espettorato. Si procederà all'omogenizzazione attraverso ditiotreitolo (DTT) al fine di rompere i ponti disulfidici contenuti nelle molecole di mucina e permettere il rilascio di cellule. Infatti le cellule che non si separano completamente dal muco tendono ad assumere una colorazione scura e la loro corretta identificazione diventa difficile. Il campione sarà successivamente agitato per 15 minuti a temperatura ambiente. Il campione sarà filtrato attraverso filtri di nailon di 48 mM e il filtrato verrà pesato. Verrà successivamente effettuata manualmente attraverso un emocitometro la conta totale delle cellule e calcolata la conta totale per millilitro di campione di espettorato. Il campione viene infine centrifugato e colorato con sistema di Wright. La conta differenziata delle cellule può essere effettuata sui campioni che presentano più di 400 cellule non squamose. Il supernatante viene aliquotato e conservato a -80 °c

Misurazione del livello di mediatori
Nello sputo indotto sarà effettuata la conta cellulare totale e differenziata (eosinofili, macrofagi, linfociti). Nel condensato e nello sputo indotto saranno misurate le concentrazioni di alcune interleuchine (IL-4, IL-5, IL-10 interferone gamma (IFN-gamma), 8-isoprostano e cisteinil-leucotrieni (LTC4/D4/E4). Tutte le misurazione saranno effettuate attraverso un'ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) con kit specifici. Inoltre nello sputo indotto sarà indagata la presenza di RNA messaggero per IL-5 e IFN attraverso la PCR e calcolato il rapporto IL-5/IFN , espressione del rapporto citochine Th2/citochineTh1.