RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Meccanismi di suscettibilità e di attivazione delle risposte tissutali e cellulari indotte dall'antigene nell'asma

Università di riferimento

Università degli Studi di GENOVA - MEDICINA INTERNA E SPECIALITA' MEDICHE - GENOVA(GE)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Vito BRUSASCO

Descrizione

L'obiettivo della nostra Unità di ricerca e quello di investigare gli effetti ed i meccanismi d'azione della sfingosina-1-fosfato (S1P) sul muscolo liscio delle vie aeree. In particolare saranno testati gli effetti di S1P sulla contrattilità e rimodellamento delle cellule muscolari lisce (CML), sulla disfunzione beta-2-recettoriale e sul rilascio di acetilcolina. Sarà inoltre testato se cellule epiteliali stimolate con S1P acquisiscono capacità rimodellante pro-contrattile sulle CML.

STUDI SU COLTURE CELLULARI. Gli effetti di S1P, del suo agonista FTY720 e dell'inibitore della sfingosina chinasi DL-treo-diidrosfingosina sulla contrattilità e sulla differenziazione delle CML bronchiali umane in coltura saranno valutati mediante indagini di immunocitochimica, proliferazione cellulare e citometria magnetica rotante. Per verificare il ruolo dell'epitelio sul rimodellamento mediato da tali sostanze, il medium di coltura condizionato di cellule epiteliali umane delle vie aeree in coltura primaria sarà aggiunto a colture di CML.

Coltura di CML umane.

Gli esperimenti verranno condotti su una linea immortalizzata di CML bronchiali umane. Le cellule saranno coltivate in terreno DMEM con aggiunta di 10% FBS, penicillina (100 microgr/ml), streptomicina (100 U/ml) e G418 (250 microgr/ml) in atmosfera umidificata in presenza di 5% CO2 a 33° e 39° C al fine di ottenere un fenotipo differenziato o primitivo rispettivamente (Zhou L. et al., Am J Respir Crit Care Med. 169:703-711, 2004) L'avvenuta differenziazione verrà testata attraverso l'utilizzo di metodologie per l'espressione e la quantificazione di alfa-SMA, vimentina e catena pesante della miosina e valutando la proliferazione cellulare con l'utilizzo di [3H]Timidina (Ammit AJ et al., FASEB J. 15:1212-4, 2001).

Coltura di cellule epiteliali bronchiali umane.

Colture primarie di cellule epiteliali saranno ottenute da tessuto polmonare prelevato da pazienti operati per neoplasia. Le cellule epiteliali verranno lasciate in una soluzione contenente proteasi XIV tutta la notte. Il giorno successivo saranno distaccate meccanicamente dal tessuto e mantenute in coltura a 37°C in CO2 al 5%. Successivamente potranno essere mantenute indifferenziate su supporti di plastica in terreno LHC9/RPMI senza aggiunta di siero o coltivate su supporti permeabili in terreno DMEM/F12 al 2% di FBS al fine di ottenere un fenotipo differenziato e lo sviluppo di tight junctions (Galietta et al. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 34:478-81, 1998).
Dopo qualche giorno in coltura, che varia a seconda del metodo adottato, le cellule potranno essere stimolate con S1P (0.1-1-10 microM) o con FTY720 (0.1-1-10 microM) o con DL-treo-diidrosfingosina (0.1-1-10 microM) e, a diversi tempi (24, 48, 72, 144 ore), i surnatanti saranno aggiunti alle colture di CML sopra descritte al fine di verificare il ruolo dell'epitelio nel remodellamento cellulare mediato da queste sostanze.

Immunocitochimica.

Le CML verranno coltivate come sopra descritto a 33° e 39° C senza (controllo) o con aggiunta di S1P (0.1-1-10 microM) o di FTY720 (0.1-1-10 microM), o di DL-treo-diidrosfingosina (0.1-1-10 microM) (test) per 24, 48, 72, 144 ore, e al raggiungimento della confluenza verranno distaccate dal supporto di coltura mediante trattamento con tripsina 0.25%, contate, risospese in terreno e citocentrifugate su vetrino caricato elettrostaticamente.
I vetrini verranno fissati all'aria e idratati con tampone fosfato, dopodiché si procederà all'incubazione con l'anticorpo specifico (per vimentina, alfa-SMA o catena pesante della miosina) in camera umida a temperatura ambiente. Dopo diversi lavaggi in tampone fosfato i vetrini verranno incubati con Envision Peroxidase con la stessa modalità adottata per l'anticorpo e lavati con tampone fosfato.
Si effettuerà quindi una incubazione con diamino benzidina controllando al microscopio l'intensità della colorazione. I vetrini verranno poi contrastati con ematossilina di Mayer, risciacquati con H2O corrente, disidratati in alcool e xilolo e montati con Eukitt.

Proliferazione cellulare.

Le CML verranno coltivate con la metodologia sopra descritta a 33° o 39° C in piastre da 96 pozzetti fino al raggiungimento della semi-confluenza, quando la loro crescita verrà arrestata dalla sostituzione del terreno di coltura con un terreno composto da HAM'S F12 senza aggiunta di FBS. I diversi pozzetti saranno incubati con S1P (0.1-1-10 microM) o FTY720 (0.1-1-10 microM) o DL-treo-diidrosfingosina (0.1-1-10 microM) (test) o saranno mantenuti senza aggiunta di mediatori (controllo) per 24, 48, 72, 144 ore.
Ad ogni pozzetto sarà aggiunto 1 microCi di [3H]Timidina per un tempo variabile da 15 a 18 ore, il terreno di coltura verrà rimosso, le cellule recuperate e il loro grado di incorporazione di [3H]Timidina misurato tramite beta-counter.

Citometria magnetica rotante.

Gli effetti della S1P, di FTY720 e di DL-treo-diidrosfingosina a diverse concentrazioni e tempi sulle proprietà delle CML (rigidità e contrattilità) saranno studiati. Le CML arrivate a confluenza saranno separate dal supporto di coltura tramite trattamento con tripsina, piastrate alla giusta densità in pozzetti precedentemente rivestiti (24h) con collagene tipo I, ed incubate con S1P (0.1-1-10 microM) o con FTY720 (0.1-1-10 microM) o con DL-treo-diidrosfingosina (0.1-1-10 microM) (test) o saranno mantenute senza aggiunta di mediatori (controllo) per 24, 48, 72, 144 ore. Allo scadere dei diversi tempi di incubazione ai pozzetti contenenti le CML saranno aggiunte biglie ferromagnetiche in egual numero (4.5 micron di diametro) ricoperte con il peptide Arg-Gly-Asp specifico per l'integrina (Fabry, B. et al. J. Appl. Physiol. 91, 986-994, 2001). Dopo un tempo sufficiente a consentire il legame delle sferule sarà applicato un campo elettromagnetico per determinarne l'allineamento. Successivamente saranno applicati impulsi elettromagnetici perpendicolari alla direzione di allineamento delle microsferule per causare deformazioni meccaniche delle CML. Analizzando gli spostamenti delle biglie elettromagnetiche sarà possibile quantificare variazioni nella contrattilità e nella rigidità delle CML. La gestione dei campi magnetici sarà affidata ad apposito software dedicato, mentre la deformazione cellulare sarà dedotta dalle immagini ricavate da una camera digitale collegata ad un microscopio ad inversione all'ingrandimento 10x.
Le concentrazioni efficaci di S1P e di FTY720, dedotte dallo studio precedente, saranno utilizzate per quantificare le modificazioni strutturali delle CML a seguito di brevi incubazioni (2 minuti) con le due sostanze in esame. Ogni esperimento sarà condotto in doppio su cellule test e cellule controllo.
A tal fine, seguendo la metodica sopra descritta, una volta allineate magneticamente le microsferule, le CML verranno sottoposte a due sequenze di impulsi elettromagnetici perpendicolari alla direzione del campo di allineamento delle microsferule. Tra le due stimolazioni le cellule test saranno incubate per due minuti con le concentrazioni efficaci di S1P e FTY720. Le misurazioni saranno eseguite come precedentemente descritto.

STUDI SU TESSUTO.

Gli effetti dell'incubazione con S1P e con FTY720 sulla contrattilità e sul rilascio di acetilcolina saranno valutati in strisce di muscolo liscio tracheale bovino (MLTB). La risposta al Salbutamolo sarà studiata in anelli bronchiali umani (ABU) trattati con S1P e con FTY720. Gli effetti di DL-treo-diidrosfingosina sulla disfunzione beta-2-recettoriale indotta dalla stimolazione allergenica e sul release di acetilcolina saranno quantificati rispettivamente in ABU e nel MLTB.

Studi su MLTB.
a)Risposta contrattile. Da ogni animale saranno ottenute per dissezione 4 strisce di MLTB. Ogni striscia sarà posizionata in bagnetto termostatato a 37°C, contenente 25 ml di soluzione fisiologica ossigenata, legandola, tramite filo di seta, da una parte ad un gancetto metallico situato sul fondo del bagnetto, dall'altra parte ad un trasduttore di forza montato su un micromanipolatore meccanico connesso ad un registratore su carta. Ogni campione tissutale risulterà, inoltre posizionato tra 2 elettrodi di platino rettangolari di 2 cm2 di superfice a loro volta connessi con un generatore di onde quadre a frequenza e voltaggio variabili. Le strisce saranno stimolate elettricamente (25V, 25Hz, 0.5ms durata di ogni singolo stimolo) ogni 5 minuti per 30 secondi, e allungate meccanicamente, tra due stimolazioni successive, fino al raggiungimento di una lunghezza di riferimento caratterizzata da un tono muscolare di circa 2 grammi. Successivamente 2 muscoli saranno incubati (30 min) con tetradottosina (TTX) 10-7M per bloccare il rilascio di neurotrasmettitori. Al termine di questa incubazione dosi crescenti S1P o FTY720 da 10-9M a 10-4M, con incrementi di mezzo punto molare in scala logaritmica negativa in base 10, saranno aggiunti rispettivamente ad un muscolo trattato ed ad un muscolo non trattato con TTX. I valori di forza saranno espressi come percentuali della contrazione indotta da S1P 10-4M o da FTY720 10-4M.

b)Rilascio di acetilcolina. 2 strisce di MLTB per ogni animale, ottenute per dissezione, saranno montate in due bagni termostatati a 37°C contenenti ciascuno 2 ml di soluzione fisiologica ossigenata. Ogni muscolo sarà posizionato all'interno del bagnetto, legandolo,da un capo, ad un elettrodo di platino vincolato ad un micromanipolatore e dall'altro ad un secondo elettrodo di platino montato all'estremità di un trasduttore di forza collegato ad un registratore su carta. Ogni bagnetto sarà connesso a due distinti circuiti idraulici, uno aperto, a volume variabile, ed uno chiuso a volume costante contenti soluzione fisiologica ossigenata e regolati da una pompa peristaltica rotativa. Il circuito aperto sarà usato per mantenere i muscoli in soluzione di Krebs ossigenata e per procedere all'incubazione dei muscoli con S1P (10-7M o 10-6M) o FTY720 (10-7M o 10-6M) o con DL-treo-diidrosfingosina (10-6M o 10-7M) mentre il secondo sarà utilizzato per l'internalizzazione di [3H]colina nel MLTB. In ogni esperimento un muscolo sarà utilizzato come controllo, mentre l'altro sarà utilizzato per testare i diversi farmaci (test). Una volta montate le due strisce muscolari saranno stimolate elettricamente (25V, 25Hz, 0.5ms durata di ogni singolo stimolo) ogni 5 minuti per 30 secondi, e allungate meccanicamente, tra due stimolazioni successive, fino a raggiungere una lunghezza di riferimento caratterizzata da un tono muscolare di circa 2 grammi. Le misurazioni che seguiranno saranno effettuate in condizioni isometriche; i due muscoli saranno incubati con 15 microCi di [3H]colina e stimolati elettricamente (25V, 25Hz, 0.5ms durata di ogni singolo stimolo) per un periodo di 30 min per favorire la liberazione, la marcatura e l'incameramento di [3H]colina. Al termine di questa fase i muscoli saranno incubati con hemicolinium-3 10-5M per inibire il re-uptake di colina e lavati per 90 min circa con soluzione fisiologica ossigenata in modo da allontanare l'eccesso di [3H]colina. Di seguito avrà inizio, in contemporanea, la raccolta del superfusato dalle due camerette in apposite vials contenenti 14 ml di liquido di scintillazione al flusso di 1 ml/min. Le vials saranno numerate e sostituite ogni 3 min. Durante la raccolta i muscoli subiranno due stimolazioni elettriche di 3 min ciascuna e, tra la prima e la seconda stimolazione, la raccolta del superfusato verrà interrotta per 10 min per permettere l'incubazione (30 min) del muscolo test con uno dei tre composti da testare. La radioattività delle singole vials verrà quantificata tramite analisi con beta counter. Ogni vial sarà analizzata tre volte per 5 minuti ed i risultati saranno espressi come disintegrazioni per minuto per grammo di tessuto. I rilasci di acetilcolina marcata indotti da stimolazione elettrica saranno calcolati come le due aree comprese tra lo spontaneo rilascio di acetilcolina e i punti situati sopra esso (A1, A2) e ad esse corrisponderanno due distinti valori di forza (F1, F2). Per valutare l'effetto dei farmaci sulla liberazione di acetilcolina e sulle risposte contrattili saranno calcolati i rapporti A2/A1 e F2/F1 dei muscoli test e controllo. I valori saranno analizzati usando il t-test per dati appaiati.

Studi su ABU.
a)Effetti di S1P e di FTY720 sulla risposta beta-2-recettoriale. Gli ABU saranno ottenuti da pazienti non atopici operati per toracotomia e resezione polmonare. Da ogni campione tissutale saranno ricavati, dove possibile, 5 ABU: un anello sarà utilizzato come controllo, due saranno incubati con S1P alle concentrazioni 10-6M e 10-7M rispettivamente, mentre i restanti due saranno incubati con FTY720 alle concentrazioni 10-6M e 10-7M rispettivamente. Le due diverse incubazioni si protrarranno per 1 ora a 37°C in soluzione fisiologica ossigenata. Al termine di queste gli anelli saranno posizionati, tramite appositi ganci metallici, all'interno di bagnetti termostatati a 37°C contenenti soluzione fisiologica ossigenata, vincolandoli, da una parte ad un gancio metallico posto sul fondo del bagno, e dall'altro ad un trasduttore di forza connesso con un registratore su carta. Successivamente, ad intervalli regolari di 15 min, gli anelli saranno allungati fino all'ottenimento di una lunghezza di riferimento corrispondente ad una tensione di riposo di circa 1 grammo. Gli anelli saranno in seguito contratti chimicamente con Carbacolo 10-6M e, raggiunta una fase di contrazione isometrica stabile, decontratti con incrementi scalari di mezzo punto, in scala logaritmica negativa in base 10, di Salbutamolo da 10-9M fino a 10-4M.

b)Gli effetti della pre-medicazione con DL-treo-diidrosfingosina sulla disfunzione Beta 2 recettoriale indotta dal caricamento allergico saranno studiati in ABU. 4 ABU per donatore saranno sensibilizzati passivamente attraverso un'incubazione di 18 h a temperatura ambiente con siero prelevato da pazienti atopici verso gli allergeni maggiori degli acari della polvere (Song et al Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 279:L209-15, 2000). Al termine del processo di sensibilizzazione due anelli saranno lavati e trattati con DL-treo-diidrosfingosina 10-6M e 10-7M rispettivamente. Successivamente i due anelli trattati ed un anello non trattato saranno incubati a 37°C per 1 h con 1000 unità arbitrarie di mix di Dermathofagoides diluito in 5 ml di soluzione fisiologica. Al termine di questi processi gli anelli saranno montati nei pozzetti termostatati contratti con Carbacolo e decontratti con Salbutamolo come descritto sopra. Eventuali spostamenti delle curve dose riposta al Salbutamolo saranno valutati tramite analisi della varianza.

STUDI IN VIVO.

Soggetti asmatici in fase di stabilità clinica e sensibili al polline di parietaria saranno sottoposti a stimolazione bronchiale segmentale con allergene con 200-1000 unità arbitrarie di allergene a seconda del loro grado di sensibilizzazione. Prima e 5 min dopo l'instillazione locale di estratto di parietaria in soluzione fisiologica sarà effettuato lavaggio bronchiale. In un bronco controlaterale si effettueranno agli stessi tempi i lavaggi prima e dopo instillazione di soluzione fisiologica di controllo. I sovranatanti recuperati saranno conservati a -70 in attesa dell'analisi quantitativa di sfingosina ed S1P.