RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Meccanismi di suscettibilità e di attivazione delle risposte tissutali e cellulari indotte dall'antigene nell'asma

Università di riferimento

Università degli Studi di FERRARA - MEDICINA CLINICA E SPERIMENTALE - FERRARA(FE)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Cristina MAPP

Descrizione

SCOPO DELLO STUDIO
Non si conosce molto sulla suscettibilita' individuale a sviluppare asma professionale (AP) (1). L'asma e' una malattia multifattoriale, e di conseguenza l'influenza dell'ambiente e' evidente soprattutto nella determinazione di caratteristiche multifattoriali. Inoltre, l'asma e' una malattia che si caratterizza per la molteplicita' di fenotipi, ed i fenotipi dell'asma che insorge in eta' adulta sono ancora oggi poco compresi (2). A questo proposito, l'AP offre il vantaggio di definire con accuratezza il fenotipo della malattia.
Gli isocianati sono un gruppo di agenti chimici a basso peso molecolare, molto reattivi, ampiamente usati, e sono gli agenti causali di AP piu' frequenti nei paesi industrializzati (3). I meccanismi con i quali gli isocianati causano asma non sono del tutto noti. Meccanismi IgE-dipendenti non spiegano alcune forme di AP indotto da agenti chimici, incluso l'asma indotto dall'esposizione ad isocianati (4). Nell'asma da isocianati, sono state osservate risposte immunitarie cellulo-mediate (5-7). Inoltre, la maggior parte di cloni di cellule T ottenuti da pazienti con asma indotto da esposizione a toluene diisocianato (TDI) sono CD8+ ed in grado di produrre interleuchina (IL)-5. Questi linfociti T possono rappresentare una popolazione CD3+/CD4-/CD8+ che esprime il recettore della cellula T g/d (8, 9). E' di interesse che linfociti ottenuti da soggetti con asma indotto da isocianati hanno una espressione significativamente diminuita del segmento del gene V beta 1 e V beta 5 prima dell'esposizione in vitro ad isocianati rispetto ai controlli. La percentuale dell'espressione genica del segmento V beta 1 e V beta 5 era selettivamente aumentata quando le cellule mononucleate del sangue periferico erano stimolate in vitro con coniugati isocianato-proteina (10). Questi risultati sono a favore dell'ipotesi che sottopopolazioni di cellule T antigene-specifiche siano sequestrate nel polmone di soggetti con asma da isocianati e che si espandano per clonazione dopo ulteriore esposizione ad isocianati.
Poter predire le proprieta' biologiche che conferiscono ad un agente chimico la potenzialita' di indurre allergia respiratoria e capire i meccanismi coinvolti nella sensibilizzazione e nello sviluppo di asma sono obiettivi importanti. E' interessante sottolineare che uno studio recente ha dimostrato che la risposta genomica delle vie aeree umane a concentrazioni di allergene in un range clinicamente rilevante coinvolge un numero maggiore di geni rispetto a quello che si riteneva in precedenza, compresi molti geni che non erano stati associati ad asma e che sono espressi in modo differenziale dopo esposizione delle vie aeree ad allergene (11). Evidenze recenti indicano un ruolo importante dell'infiammazione, del rimodellamento delle vie aeree e dell'attivazione dell'epitelio nella genetica dell'asma (12). Il linkage dell'asma di fenotipi correlati al cromosoma 6p21 e' stata riportata in sette screening del genoma, rendendo questa regione del genoma come la piu' replicata. Uno studio recente ha dimostrato che il gene dell'HLA-G e' un nuovo gene dell'asma e dell'iperresponsivita' bronchiale, ed e' localizzato sul cromosoma 6p21 (13). D'altra parte, polimorfismi dei geni delle citochine possono influenzare le risposte immunitarie, l'infiammazione, ed il danno tissutale. E' noto che il polimorfismo nella posizione -1082 (G/A) nel gene promotore dell'IL-10 sembra controllare la produzione di RNAm e la quantita' di proteina espressa (14). E' stato suggerito che siano richiesti livelli differenti di IL-10 per produrre livelli simili di HLA-G5/sHLA-G1 in risposta al LPS in base a genotipi diversi dell'HLA-G 14 bp (15).
Lo scopo del progetto e' di studiare, in un modello di asma non IgE-mediato ad insorgenza in eta' adulta (es. soggetti con asma indotto da isocianati): 1. la presenza ed i livelli di sHLA-G e di IL-10 nelle culture di supernatanti di PMCSs attivati con LPS; la distribuzione dei 2. polimorfismi del gene HLA-G 14 bp; e dei polimorfismi del gene dell'IL-10 (-1082, -592) a livello del DNA.
I risultati ottenuti possono identificare associazioni di alleli differenti, dimostrare la presenza o l'assenza di similitudini tra asma IgE-mediato ed asma non IgE-mediato, e migliorare la diagnosi e la prevenzione del tipo piu' frequente di asma professionale, quello indotto dall'esposizione ad isocianati. Dato che e' stato dimostrato che questo tipo di AP condivide alcune delle caratteristiche dell'asma intrinseco (16), i risultati di questo progetto possono anche chiarire i meccanismi coinvolti nell'asma intrinseco e sottolineare le somiglianze o le differenze tra asma intrinseco ed asma allergico.
Materiali e metodi
Soggetti
Il fenotipo dei soggetti inclusi nello studio sara' caratterizzato in dettaglio ed un consenso informato scritto sara' richiesto ad ogni soggetto prima dell'inizio dello studio. L'eta' dei soggetti sara' compresa nella fascia di eta' 18-70 anni. Un gruppo di 25 soggetti con asma da isocianati sara' studiato per la determinazione dei livelli di sHLA-G e di IL-10 nelle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) stimolate con lipopolisaccaride (LPS). I controlli saranno 24 soggetti sani e 20 pazienti con asma non professionale.
Un gruppo di 70 soggetti con AP indotto da isocianati sara' esaminato per il polimorfismo 14 bp nell'esone 8 (3' UTR) del gene dell'HLA-G. I controlli saranno 100 soggetti sani e 70 pazienti con asma IgE-mediato. Nel gruppo di soggetti con AP, saranno anche studiati i polimorfismi -1082 A/G e -592 A/C del gene dell'IL-10.
Culture di cellule mononucleate
Le cellule mononucleate del sangue periferico saranno ottenute con centrifugazione su Ficoll (Cederlane, Hornby, Ontario, Canada) e saranno risospese nel terreno di coltura Iscove (Biochrom, Berlino, Germania) con l'aggiunta del 10% di siero di vitello alla concentrazione di 1 x 106 ml e tenute in coltura per 48 ore. Saranno aggiunti lipolisaccaride (LPS) (Calbiochem, La Jolla, California, Stati Uniti d'America) alla concentrazione di 10 ng/ml, 10 ng/ml di anticorpo purificato anti IL-10 umana (Ebioscience, San Diego, California, Stati Uniti d'America) e 20 ng/ml di rIL-10 (PeproTech Inc., Rocky Hill, New Jersey, Stati Uniti d'America). La vitalita'e la percentuale delle cellule CD14+ saranno valutate mediante citofluorimetro a flusso (FACS), usando la colorazione ioduro di propidio e l'anticorpo anti-CD14 umano coniugato con fluorescina isotiocianato (Cymbus Biotechnology Ltd, Hants, Regno Unito).
Livelli di SHLA-G
I livelli di HLA-G5/sHLA-G1 saranno determinati in triplicato nei campioni di siero non diluito e nei supernatanti delle culture cellulari come precedentemente (17). In breve, l'anticorpo monoclonale MEM-G9 (Exbio, Praha, Czech Republic), che riconosce la molecola HLA-G nella forma associata alla β2 microglobulina (HLA-G1 solubile (cioè HLA-G1 legata alla membrana che si è dissociata) ed isoforma solubile HLA-G5), sarà fatto adsorbire su piastre da 96 pozzetti (Nunc-Immuno Plate PolySorp). L'anticorpo monoclonale sarà usato in concentrazione di 20 μg/ml in tampone carbonato 0,1 M a pH 9,5 e le piastre saranno incubate per un'ora a 37°C e, successivamente, durante la notte a 4°C. Dopo tre lavaggi con tampone fosfato (PBS) contenente 0.05% Tween 20 (PBS-Tween), le piastre saranno saturate durante la notte a 4 °C con 100 μl di PBS contenente BSA 4%. Ad ogni pozzetto si aggiungeranno 50 μl di campione. Le piastre saranno incubate a 37° C per due ore, lavate tre volte in PBS-Tween e, quindi, incubate per un'ora a 37° C con 50 μl di anticorpo monoclonale biotinilato W6/32 che riconosce un motivo determinante espresso dalla β2 microglobulina associata alla catena pesante di HLA di classe I (ATCC, Rockville, MD). L' anticorpo monoclonale W6/32 sarà biotinilato usando l' EZ-Link Sulfo-NHS-LC Biotinylation kit (Pierce, Rockford, IL). Dopo 5 lavaggi con PBS-Tween, le piastre si incuberanno a 37° C per 15 minuti con 100 μl di extravidina-perossidasi (Sigma-Aldrich, Italy). Dopo 5 lavaggi con PBS-Tween, ad ogni pozzetto si aggiungeranno 100 μl del substrato della perossidasi o-fenildiamina (Sigma-Aldrich, Milano, Italy) e si incuberà a temperatura ambiente per 15 minuti. La concentrazione di HLA-G5/sHLA-G1 sarà stimata come media di letture dell'assorbanza a 450 nm eseguite in triplicato su lettore di micropiastre (ELISA Microplate Reader 400; Packard, Meridien, CT). Le curve standard di calibrazione saranno costruite con i supernatanti di LCL 721.221 transfettate con HLA-G. I supernatanti saranno purificati tramite cromatografia di affinità usando l'anticorpo monoclonale anti-HLA di classe prima, W6/32. Il limite di sensibilità è 1.0 ng/ml.
Concentrazioni di IL-10
Il kit commerciale Human IL-10 BioSource Immunoassay Kit (Human IL-10 US; BioSource, Camarillo, CA, USA) sarà usato per determinare in triplicato le concentrazioni di IL-10 nei supernatanti non diluiti delle culture e nei sieri diluiti 1:10. Il limite di sensibilità del kit è di 0.2 pg/ml.
Estrazione di DNA genomico
Il DNA genomico sarà estratto tramite un kit commerciale (Nucleon; Amersham Biosciences, Backinghamshire, UK), seguendo le istruzioni del fornitore.
Genotipizzazione del polimorfismo di 14 pb nell'esone 8(3'UTR) del gene dell' HLA-G.
Il polimorfismo di 14 pb del gene HLA-G sarà genotipizzato tramite PCR come descritto in precedenza (18). In breve, in un volume di reazione di 25 μl saranno amplificati 100 ng di DNA genomico con una concentrazione finale dei reagenti di: Reaction Buffer (Roche, Basel, Switzerland) 1x; ogni dNTP (Roche, Basel, Switzerland) 0.2 mM; MgCl2 (Roche, Basel, Switzerland) 1.5 mM; Taq Polimerasi (Roche, Basel, Switzerland) 0.75 Unità; ogni primer (GE14HLAG, RHG4) 10 pmol. Le condizioni dei cicli termici saranno: 94 ° C per 2 min, 25 cicli di 94 ° C 30 s, 64 °C 60 s, 72 ° C 120 s, e quindi 72 ° C per 10 minuti. I prodotti di amplificazione saranno visualizzati tramite elettroforesi su gel d'agarosio al 2,5% (Invitrogen, Paisley, Scotland, UK), contenente etidio bromuro (0.5 mg/ml).
Genotipizzazione dei polimorfismi -1082 A/G e –592 A/C del gene dell' IL-10
La genotipizzazione del polimorfismo -1082 A/G del gene IL-10 sarà basata sulla tecnica di PCR precedentemente descritta (19). 100 ng di DNA genomico saranno amplificati in un volume di reazione di 50 μl con Reaction Buffer (Roche, Basel, Switzerland) 1x; ogni dNTP (Roche, Basel, Switzerland) 0.2 mM; MgCl2 (Roche, Basel, Switzerland) 1.5 mM; Taq Polimerasi (Roche, Basel, Switzerland) 0.75 Unità; ogni primer 10 pmol. Le condizioni dei cicli termici saranno: 96°C per 2 min, 10 cicli di 96°C 20 s, 65°C 50 s, 72°C 40 s, 20 cicli di 96°C 20 s, 60°C 50 s, 72°C 40 s. I prodotti di amplificazione saranno sottoposti ad elettroforesi su gel d'agarosio al 2% contenente 0.5 mg/ml di etidio bromuro.
La genotipizzazione del polimorfismo-592 A/C del gene IL-10 sara' eseguita con la tecnica del polimorfismo della lunghezza dei frammenti di restrizione (RFLP) generati con BslI (20).

Referenze
1. Mapp CE. Genetics and the occupational environment. Curr Opin Allergy Clin Immunol 2005; 5(2):113-8.
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