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Programma di ricerca
Meccanismi di suscettibilità e di attivazione delle risposte tissutali e cellulari indotte dall'antigene nell'asma
Università di riferimento
Seconda Università degli Studi di NAPOLI -
INTERNISTICA CLINICA E SPERIMENTALE "FLAVIANO MAGRASSI" - CASERTA(CE)
Responsabile dell'Unità di ricerca
Raffaele DE PALMA
Descrizione
Questa UO verificherà l'ipotesi che il polline possa essere considerato un insieme di antigene nominale più adiuvante, perciò abile di per se a stimolare le cellule del sistema immunitario innato e pertanto a polarizzare la risposta T verso un profilo Th2 e risultare nella produzione di IgE. Concentreremo il nostro interesse su cellule presentanti l'antigene (APCs), Eosinofili (EOs), Mastociti (MCs), Linfociti T. Gli obiettivi principali saranno:1)Caratterizzazione dei meccanismi di processazione e presentazione di differenti componenti presenti nel polline della Parietaria judaica (Pj), caratterizzazione che verrà fatta analizzando la produzione di citochine e chemochine da parte delle APCs in presenza di estratti appositamente preparati; 2)Valutazione della capacità degli estratti di reclutare e/o attivare, direttamente od indirettamente, le cellule dell'immunità naturale con particolare riferimento a eosinofili e mastociti; 3)Analisi degli effetti dei differenti estratti sulla risposta T mediante analisi del repertorio T per l'antigene e misurazione della produzione delle citochine. Questi esperimenti verranno condotti in parallelo su pazienti atopici e non atopici. 4)Ruolo di S1P come mediatore "principe" nel coordinare queste cellule nel corso della risposta a questo allergene. Le APCs che verranno utilizzate per verificare il primo obiettivo saranno cellule dendritiche (DCs), preparate secondo un protocollo standard isolando monociti dal sangue periferico. I monociti verranno separati mediante sorting immunomagnetico, utilizzando biglie ricoperte con anticorpo anti-CD14. Le cellule così recuperate verranno poste in coltura per una settimana con GM-CSF e IL-4. La valutazione della preparazione di DCs sarà fatta mediante analisi citofluorimetrica e valutando l'espressione dei seguenti marker di superficie: HLA-Classe I, HLA-Classe II, CD40, CD11c, CD14. Le DCs preparate come descritto verranno incubate con 1)estratto crudo di polline di Parietaria; 2)Proteina Pj purificata, corrispondente all'allergene maggiore purificato (Par j1); 3)estratto di polline deproteinato; 4)estratto depleto della parte carboidratica; 5)estratto defosforilato; 6)estratto contenente soltanto la componente lipidica e, in alcuni esperimenti, useremo il 7)polline intero. Come controllo, useremo in alcuni esperimenti Parj1 ricombinante. I differenti estratti verranno preparati dai granuli di polline della Parietaria judaica (Allergon, Svezia) in modo da avere granuli appartenenti ad una ben definita specie. L'estratto crudo sarà preparato utilizzando una soluzione 0.125M di tampone bicarbonato secondo un protocollo utilizzato da noi ed altri gruppi (25,27,28,34). Partendo da questo estratto prepareremo l'estratto deproteinato utilizzando una soluzione 3M/NaOH/0.1M NaBH4 o difestione con proteinasi K. Gli zuccheri saranno rimossi utilizzando TFMS o sodio periodato, i fosfati saranno eliminati mediante fosfatasi. Gli estratti contenenti solo lipidi o solo carboidrati saranno preparati come descritto in precedenza mediante estrazione degli estratti e separazione in cromatografia (27,28). Ogni estratto, preparato come descritto, verrà analizzato per la presenza di LPS mediante saggio di Limulus. Le DCs saranno preparate, come sopra descritto, da pazienti atopici e da individui non atopici esposti alla Parietaria, come pure da soggetti non esposti alla Parietaria (questi ultimi campioni verranno forniti dalla UO diretta dalla Prof. Mapp). Tutti i soggetti, prima del prelievo saranno informati dello studio e gli verrà richiesto consenso informato. Le Dcs verranno incubate coi differenti estratti e verrà poi analizzata in citofluorimetria l'espressione di molecole di superficie indicanti la maturazione delle DCs (CD1a, CD14, CD83, CD86, CD40, HLA-Classe II). Inoltre, analizzeremo il sovranatante delle differenti colture per la presenza di gamma-IFN, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12, IL-13 per ELISA. In queste stesse colture valuteremo al contempo l'espressione delle seguenti chemochine: MIP-1a, MIP-1b, MCP-1, MCP-2, RANTES, TARC e IL-8. La produzione di chemochine verrà valutata mediante PCR quantitativa sul cDNA preparato dalle differenti colture utilizzando reagenti comunemente reperibili in commercio (Taqman-Applied Biosystems) per l'amplificazione e seguendo protocolli descritti. Per minimizzare i problemi dovuti alla differente cinetica di produzione delle chemochine, quest'analisi verrà condotta a tempi differenti (0, 3 ore e 30 ore). L'Istamina è uno dei principali mediatori delle reazioni allergiche, inoltre è stato dimostrato che l'Istamina può condizionare il tipo di citochine prodotto dalle DCs legandosi ai suoi recettori (H1 e H2) espressi su queste cellule. Per questa ragione, in questi esperimenti valuteremo in PCR quantitativa anche l'espressione di di recettori H1 e H2 sulle DCs. Insieme, questi esperimenti chiariranno gli effetti dei differenti estratti pollinici sul profilo funzionale delle DCs. Ci aspettiamo, a questo proposito, che i differenti composti presenti nell'intero polline siano in grado di influenzare fortemente la produzione di citochine e chemochine da parte delle DCs. Inoltre, va sottolineato che le DCs utilizzate per questi esperimenti verranno ottenute da gruppi di soggetti differenti, come sopra descritto, pertanto potremo capire se le DCs assumono un profilo funzionale ed indirizzano il tipo di risposta T a seconda dei differenti composti o la loro funzione sia principalmente dovuta a fattori inerenti allo stato di atopia. In questi sperimenti misureremo la produzione di S1P utilizzando spettrometria di massa. In breve, estrarremo il sovranatante delle culture con solventi organici e li analizzeremo mediante LC-MS/MS per avere spettri preliminari di prima e seconda frammentazione. Abbiamo disponibile uno standard interno (AVANTI LIPIDS-USA) che ci permette di misurare e quantizzare picomoli di S1P e del suo precursore, la sfingosina. La tecnica per la misurazione della S1P è correntemente da noi utilizzata in collaborazione con personale CNR presso la nostra Università. I mastociti (MCs) sono effettori per eccellenza nelle immunoreazioni di tipo I. Cellule Mononucleate (MNCs) verranno isolate da PBMCs e messe in coltura su metilcellulosa usando medium Stem-cell Technologies, Vancouver, Canada) e medium Iscove-Dulbecco modificato (INDM) contenente SCF a 200 ng/ml, IL-6 a 50 ng/ml e IL-3 a 1ng/ml come riportato in precedenza. Al 42esimo giorno di coltura, la metilcellulosa verrà dissolta con PBS, le cellule saranno risospese e coltivate in INDM contenente SCF a 100 ng/ml e IL-6 a 50ng/ml con il 2% di FCS. In seguito all'attivazione, i mastociti producono diverse citochine, incluso TNF-alpha, GM-CSF, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 e IL-13. E' stato descritto che MCs possono processare e presentare antigeni, perciò è possibile che svolgano un ruolo importante nella polarizzazione delle risposte immuni verso un tipo Th1 o Th2 (35). Va sottolineato che, anatomicamente,MCs e DCs sono vicine nei tessuti periferici, per questo è possibile che, prima ancora che ci sia il riconoscimento dell'allergene da parte delle cellule T, queste due cellule possano tra loro "comunicare" tramite la produzione di citochine e chemochine influenzando il tipo di risposta T. Analizzeremo tre aspetti dell'attivazione dei MCs in risposta al polline o ai suoi componenti, e cioè produzione di citochine e chemochine, la chemiotassi e la degranulazione. Questi tre aspetti verranno analizzati in MCs preparati da gruppi di individui come descritto per le DCs. Per quanto riguarda la produzione di fattori solubili, i MCs verranno coltivati con i differenti estratti e i sovranatanti delle culture saranno testati in ELISA per la produzione di TNF-alpha, GM-CSF, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 e IL-13. Le cellule saranno quindi analizzate in citofluorimetria per l'espressione di recettori per le chemochine CCR3, CXCR3, CCR1, CCR5 e CXCR4. Inoltre, prepareremo cDNA da queste cellule per studiare la produzione di MIP-1a, MIP-1b, RANTES, TARC e IL-8. Sulla base dei lavori citati riguardanti S1P e MCs, condurremo esperimenti di chemiotassi utilizzando i diversi estratti pollinici misurando il rilascio di S1P e la chemotassi dei MCs. Gli esperimenti di chemiotassi verranno eseguiti utilizzando piastre Transwell a 24 pozzetti con filtro in policarbonato con pori di 8micron come descritto. In breve, il medium contenente il supposto stimolo chemiotattico verrà posto nella camera inferiore del Transwell, 1 x105 Eos purificati verranno sospesi nella camera superiore. Il transwell sarà incubato per 3 ore a 37°C in ambiente umidificato contenente il 5% CO2. La migrazione cellulare sarà determinata contando le cellule migranti attraverso il filtro o recuperando le cellule dalla camera inferiore e contandole in camera di Burker. La degranulazione verrà valutata mediante il rilascio di Istamina. Un volume equivalente di MCs o EOs in PIPES buffer verrà incubata con lo stimolo pre-riscaldato. La reazione sarà fermata per centrifugazione e il sopranatante verrà conservato a –20°C per determinarne il contenuto di Istamina, dosaggio eseguito mediante una tecnica fluorimetrica standard (36). Allo scopo di valutare l'importanza delle IgE nel processo, questi esperimenti verranno condotti anche in assenza ed in presenza di Ig. Sarebbe di estremo interesse l'identificazione di componenti polliniche in grado di stimolare la degranulazione, anche in minima parte, senza l'ausilio delle IgE. Questi esperimenti ci permetteranno di verificare l'attività delle differenti componenti del polline sulla chemiotassi e degranulazione di queste cellule. Testeremo anche la possibilità che l'intero granulo pollinico possa attivare direttamente MCs o EOs, stimolandoli alla produzione di fattori solubili (chemochine e citochine) indirizzando la risposta. Separeremo gli EOs dal sangue dei pazienti così come descritto secondo un protocollo diffuso e da noi minimamente modificato (30), usando biglie immunomagnetiche e un sistema di separazione cellulare magnetico. Sangue intero, diluito 1:5 in PBS sarà stratificato su gradiente di Percoll (d=1.088 g/liter) e centrifugato a 400 g x 30 min. Il pellet di granulociti, composto principalmente da neutrofili e eosinofili sarà recuperato e gli eritrociti presenti saranno lisati mediante l'uso di soluzione salina ipotonica. A questo punto, le cellule verranno incubate a 4°C per 30 min con biglie magnetiche ricoperte con anticorpi anti CD16 e anti CD3, in modo da rimuovere la contaminazione di neutrofili e linfociti rispettivamente. Infine, recupereremo gli EOs mediante passaggio su magnete. Le cellule preparate di fresco verranno quindi risospese alla concentrazione di 3x106/ml in PBS contenente l'1% di BSA ed analizzate in citofluorimetria utilizzando anti CD3, anti CD16 e anti CD19 allo scopo di verificare la purezza della preparazione. Usando questo protocollo noi riusciamo solitamente ad ottenere preparazioni con grado di purezza di EOs >al 97%. L'attivazione degli Eos verrà analizzata come descritto per i MCs, analisi di produzione di fattori solubili, chemotassi e degranulazione. Le analisi condotte saranno molto simili con l'eccezione di alcuni fattori specifici per gli EOs che valuteremo in questi esperimenti. L'espressione di CCR1, CCR3 e CCR5 verrà valutata per citofluorimetria. Il dosaggio di RANTES, Eotassina e MCP-1 verrà effettuato per PCR quantitativa. Studieremo il rilascio di leucotrieni e TGF-beta (prodotti in queste cellule in seguito alla degranulazione) nei sopranatanti per ELISA. I risultati ottenuti in questo set di esperimenti serviranno da guida per gli esperimenti condotti in vivo dalla UO diretta dal Prof Lampa. In più, prepareremo esperimenti di chemiotassi utilizzando Transwell ed utilizzando le diverse cellule in presenza dei differenti estratti preparati. Questi esperimenti serviranno al dosaggio di S1P, allo scopo di valutare la possibilità che questo fosfolipide possa, attraverso l'induzione di chemochine e citochine, essere responsabile della "comunicazione" tra queste cellule. Questi risultati saranno di estremo interesse quando combinati con gli esperimenti che l'UO diretta dal Prof. Brusasco effettuerà mirando a caratterizzare gli effetti di S1P sulle cellule muscolari lisce (SMCs). Uno degli obiettivi della nostra UO, come detto, sarà caratterizzare il ruolo delle cellule T in questo scenario. Per fare questo, noi saggeremo l'effetto delle differenti preparazioni polliniche sul profilo funzionale del repertorio T specifico per l'allergene. Stimoleremo PBMCs con 1)Estratto intero; 2)Proteina PJ purificata; 3)Estratto Deproteinato; 4)Estratto depleto di carboidrati; 5)Estratto defosforilato; 6)Pj ricombinante. Questi sei componenti verranno utilizzati per generare linee T in triplicato da ogni soggetto. La specificità delle linee verrà saggiata mediante una incorporazione standard di Timidina. Le linee che si riveleranno essere specifiche verranno analizzate per citofluorimetria dopo colorazione con anti corpi anti CD4, CD8, CD25, CD16, CD40L, Studieremo anche il repertorio T di queste linee, come pure la produzione di gamma-IFN, TGF-beta, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IL-13 mediante PCR quantitativa. Le cellule di partenza verranno ottenute da individui atopici e non atopici, esposti e non esposti come sopra specificato. Inoltre, l'UO diretta dalla Prof.ssa Mapp fornirà l'analisi dei polimorfismi dell'IL-10 allo scopo di identificare un possibile marker che determini a priori la risposta favorendo uno sbilanciamento della risposta (ad esempio diminuzione delle cellule capaci di fare regolazione per inefficacia funzionale o ridotta produzione di IL-10 legata a determinati polimorfismi). Da questi esperimenti impareremo potremo sapere se esistono delle risposte specifiche, in termini di repertorio ed in termini funzionali, dipendenti esclusivamente o in gran parte da proprietà delle differenti componenti polliniche. La combinazione delle analisi proposte dovrebbe permetterci di identificare eventuali popolazioni T che rispondono a particolari componenti del polline come,peraltro, abbiamo già dimostrato in precedenza identificando una popolazione CD8 T alpha/beta capace di riconoscere un isoflavone presente nel polline di Pj (27,28). Questi esperimenti ci permetteranno anche di valutare presenza e ruolo di cellule a fenotipo regolatorio (Treg) CD4+ CD25+ comparando il fenotipo ed i risultati funzionali ottenuti nelle linee derivati dai diversi soggetti. Il processing e la presentazione dell'antigene possono influenzare il tipo di risposta e per analizzare questo punto prepareremo altri esperimenti. Utilizzeremo DCs o MNCs preincubati con i differenti estratti preparati. Dopo l'incubazione, l'eccesso di antigene verrà lavato da queste cellule e aggiungeremo a queste colture cellule T purificate mediante eliminazione delle cellule aderenti e delle cellule CD19 mediante sorting immunomagnetico. In questi esperimenti utilizzeremo anche granuli pollinici interi. Questi esperimenti ci diranno se i componenti di pollinici di per se possono stimolare diversi repertori T. Il repertorio T sarà analizzato mediante analisi della lunghezza della regione CDR3, tecnica in cui abbiamo lunga esperienza ed oggi largamente accettata per lo studio delle specificità della risposta T (37-42). Tutti gli esperimenti descritti serviranno a chiarirci: Effetti delle differenti preparazioni polliniche sull'attivazione, la chemiotassi ed il profilo funzionale delle principali cellule coinvolte nella risposta all'allergene, cioè le DCs, MCs EOs e le cellule T; Produzione di S1P nel corso di questa risposta ed il suo ruolo nel determinare il coordinamento tra le cellule nella risposta; Identificazione di particolari meccanismi di processazione e presentazione in grado di indirizzare la risposta T.
