RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Meccanismi di suscettibilità e di attivazione delle risposte tissutali e cellulari indotte dall'antigene nell'asma

Università di riferimento

Seconda Università degli Studi di NAPOLI - MEDICINA SPERIMENTALE - CASERTA(CE)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Enrico LAMPA

Descrizione

Lo scopo principale di questa unità di ricerca sarà quello di caratterizzare i meccanismi di attivazione delle risposte tissutali e cellulari nelle vie aeree indotte dalla sensibilizzazione all'allergene in modelli animali.
In particolare gli obiettivi specifici di questa UR possono essere schematizzati come segue:
esperimenti in tessuti isolati (polmoni isolati e perfusi di topo), una parte dei quali saranno effettuati su tessuti provenienti da topi transgenici; esperimenti in vivo (topi e conigli) di cui una parte saranno effettuati su topi transgenici.
Esperimenti su tessuti isolati
Valutazioni funzionali in polmoni isolati e perfusi di topo
Topi C57Bl/6 saranno stabulati in locali con una temperatura di 21 ± 1°C, con un'umidità relativa del 55 ± 5% e con un regolare ciclo di alternanza luce/buio (luce dalle 07.00 alle 19.00); cibo ed acqua saranno liberamente disponibili. Le procedure sperimentali rispettano il Decreto Legislativo 116/92.
Gli animali saranno sensibilizzati con polline della parietaria judaica (pjp) (0,25 mL soluzione fisiologica, 1 mg di AL(OH)3, 1 mg di allergene). Dopo 28 giorni dalla prima somministrazione, gli animali saranno nuovamente trattati con la stessa quantità di antigene, al fine di indurre una risposta immunitaria IgE diretta verso l'antigene. Per valutare l'avvenuta sensibilizzazione, sarà utilizzata la procedura gia' descritta precedentemente negli esperimenti sui conigli sensibilizzati.
I gruppi sperimentali saranno i seguenti: a) animali normali esposti alla soluzione salina; b) animali normali esposti a pjp; c) animali sensibilizzati in maniera acuta con pjp ed esposti alla soluzione salina; d) animali sensibilizzati in maniera acuta con pjp ed esposti a questo allergene. In altri esperimenti, per gli animali transgenici per i sottotipi recettoriali della S1P gli animali saranno suddivisi secondo lo schema sopra riportato.
Animali e chirurgia
Una camera, funzionante come gabbia toracica artificiale, costruita in modo da consentire la chirurgia, la perfusione e la ventilazione polmonare. Gli animali saranno anestetizzati con 160 mg/Kg di pentobarbitale sodico. Dopo incisione della pelle in senso caudo–craniale sarà esposta la trachea che, mediante un piccolo taglio, sarà intubata. La cannula inserita all'interno della trachea sarà collegata ad un pneumotacografo mediante un tubicino di silicone. A questo punto il polmone sarà ventilato con una pressione positiva (90 respiri/min, 250-300μl tidal volume). L'addome verrà aperto e, dopo rimozione del diaframma, il topo verrà eparinizzato, mediante iniezione di eparina intracardiaca. Dopo dissanguamento mediante incisione della vena renale, il torace sarà aperto e le due metà fissate alla cameretta in modo da esporre cuore e polmoni. A questo punto, mediante un piccolo taglio effettuato a livello del ventricolo destro, alla base dell'arteria, sarà incannulata mediante una cannula di perfusione, l'arteria polmonare. Un secondo taglio verrà fatto sotto il ventricolo sinistro dove verrà inserita la seconda cannula in modo da permettere la fuoriuscita del perfusato. Il polmone verrà inizialmente perfuso con un flusso di circa 0.6 ml/min. La camera sarà quindi chiusa e agendo su un'apposita valvola di scambio, sarà generata una pressione di ventilazione negativa oscillante tra –2 e –10 cm H2O per un volume respiratorio di 200 μl. La camera per alloggiamento del topo è costituita da una intercapedine che permette l'entrata di acqua distillata, riscaldata in un bagnetto termostatico settato a 37° C. Tale camera è posizionata in modo da formare un angolo di circa 20 gradi con l'asse orizzontale, pertanto la parte superiore della camera (apici dei polmoni) risulterà essere elevata di circa 1 cm sul piano verticale rispetto alla parte inferiore della camera (basi dei polmoni). I polmoni saranno perfusi, attraverso l'arteria polmonare, in modo continuo e costante con un flusso (generato da una pompa peristaltica, Ismatec MS Reglo) di 1 ml/min, in grado di generare una pressione arteriosa polmonare di 2-3 cm H2O. Il buffer di perfusione (37º C) sarà costituito dal mezzo di coltura RPMI 1640, privato del rosso fenolo, e albumina al 4% a basso contenuto di endotossine. I polmoni saranno ventilati con una pressione negativa (da –3 a –9 cm H2O), con 90 atti respiratori al minuto e un volume respiratorio di circa 200 μl . La pressione toracica (camera artificiale) sarà misurata grazie ad un trasduttore differenziale di pressione (Validyne DP 45-24) e il flusso respiratorio mediante un pneumotacografo connesso ad un altro trasduttore differenziale di pressione (Validyne 45-15). L'aria che arriva ai polmoni viene umidificata da un apposito sistema posizionato in prossimità della cannula tracheale. La pressione arteriosa sarà continuamente monitorata grazie ad un trasduttore di pressione (isotec Healthdyne) connesso alla cannula di perfusione dell'arteria polmonare. Tutti i dati saranno raccolti e trasferiti ad un computer per essere analizzati grazie al software Pulmodyn (Hugo Sachs Elektronik, March Hugstetten, Germany). Per l'analisi dei meccanismi polmonari sarà utilizzata la formula P=V·C-1 + Rl • dV/dt-1, dove P è la pressione della camera, C le compliance polmonari, V il volume respiratorio, e RL le resistenze delle vie aeree. Generalmente dopo 60 min dall'inizio dell'esperimento la media del volume respiratorio risulta di circa 0.21±0.02 ml, la media delle resistenze aeree circa 0.23±0.08 cm H2O s ml-1, e la media della pressione polmonare arteriosa circa 2.9±1.4 cm H2O. Il valore delle resistenze ottenuto viene corretto del valore di 0,6 cm H2O s ml-1 perché tiene conto della resistenza del pneumotacografo e della cannula tracheale.
Dopo la preparazione i polmoni saranno perfusi e ventilati per 45 min. per la registrazione delle condizioni basali e sarà effettuata una curva dose-risposta all' NPS. In più, in animali con o senza pretrattamento con NPS (10-4 M), sarà perfusa serotonina (da 10-11 M a 10-6 M) per ottenerne una curva dose-risposta. Durante gli esperimenti, ogni 10 min. saranno prelevati campioni di perfusato ed immediatamente congelati, per la valutazione delle citochine.. Alla fine degli esperimenti, campioni di polmoni saranno messi in azoto liquido e conservati a -80°C. In collaborazione con i gruppi di De Palma e Brusasco su questi campioni si effettueranno gli studi di immunoistochimica e RT-PCR.
Esperimenti in vivo
Esperimenti in vivo su topo:
Durante gli esperimenti saranno utilizzati topi C57B1/6 e la responsività delle vie aeree sarà registrata usando la metodica descritta da Riffo-Vasquez Y et al., 2004. I gruppi sperimentali saranno i seguenti: a) animali normali esposti alla soluzione salina; b) animali normali esposti a pjp; c) animali sensibilizzati in maniera acuta con pjp ed esposti alla soluzione salina; d) animali sensibilizzati in maniera acuta con pjp ed esposti a questo allergene; Un gruppo di animali, sensibilizzati in maniera acuta, al secondo giorno del protocollo sperimentale, verrà pretrattato con sfingosina 1-fosfat (S1P 10-9M -10-6 M) altri con S1P dopo trattamento con antileucotrieni (montelukast, 3-10 mg/kg) ed in ultimo un gruppo di animali sarà pretrattato con desametasone (6 mg/kg i.p., per tre giorni consecutivi; la cui ultima somministrazione precede di 1h il challenge con l'antigene) prima del challenge con S1P. In altri esperimenti sui topi transgenici gli animali saranno suddivisi negli stessi gruppi sopra descritti. Il lavaggio broncoalveolare sarà effettuato utilizzando il metodo descritto da Riffo-Vasquez Y. et al., 2004 e sarà valutata la produzione di IL-4 e IL-5, nonché la produzione di IL-10 e di altre citochine mediante colorazione intracellulare e analisi di flusso delle cellule recuperate dal BAL.
Infiammazione delle vie aeree e risposta funzionale in conigli sensibilizzati in maniera acuta.
Gli animali saranno stabulati in locali con una temperatura di 21 ± 1°C, con un'umidità relativa del 55 ± 5% e con un regolare ciclo di alternanza luce/buio (luce dalle 07.00 alle 19.00); cibo ed acqua saranno liberamente disponibili. Le procedure sperimentali rispettano il Decreto Legislativo 116/92. Saranno utilizzati conigli New Zeland White germ-free (Harlan Italy S.r.l.) di un mese di vita di entrambi i sessi, che saranno sensibilizzati con polline della parietaria judaica (pjp) (0,25 mL soluzione fisiologica, 1 mg di AL(OH)3, 1 mg di allergene). Dopo 28 giorni dalla prima somministrazione, i conigli saranno nuovamente trattati con la stessa quantità di antigene, al fine di indurre una risposta immunitaria IgE diretta verso l'antigene. Per valutare l'avvenuta sensibilizzazione, al termine del periodo di trattamento, gli animali saranno sottoposti a test cutaneo e immunoblotting. Per il test cutaneo una soluzione di pjp (1:100 000) sarà somministrata nella porzione dorsolaterale del corpo dei conigli (0,05 mL per sito), previa rasatura. La comparsa dei segni dell'infiammazione nei siti di inoculo, 15 minuti dopo il test, sarà considerata indice di avvenuta sensibilizzazione. Per gli esperimenti di immunoblotting l'estratto allergenico in un tampone Tris-HCl (pH=8), contenente 2% di SDS, sarà bollito per 5 minuti e verrà effettuata una corsa elettroforetica su gel al 15% di poliacrilamide. Le proteine così separate saranno trasferite su carta di nitrocellulosa, incubata con siero proveniente da animali normali (controllo) o sensibilizzati. Il segnale sarà sviluppato con siero IgG anticoniglio biotinilato (Sigma, Milano, Italia) e streptavidina per ossidasi (Sigma, Milano, Italia) con diamino benzidina (Sigma, Milano, Italia) come substrato. I gruppi sperimentali saranno i seguenti: a) animali normali esposti alla soluzione salina; b) animali normali esposti a pjp; c) animali sensibilizzati in maniera acuta con pjp ed esposti alla soluzione salina; d) animali sensibilizzati in maniera acuta con pjp ed esposti a questo allergene; Un gruppo di animali, sensibilizzati in maniera acuta, al secondo giorno del protocollo sperimentale, verrà pretrattato con sfingosina 1-fosfat (S1P 10-9M -10-6 M) altri con S1P dopo trattamento con antileucotrieni (montelukast, 3-10 mg/kg) ed in ultimo un gruppo di animali sarà pretrattato con desametasone (6 mg/kg i.p., per tre giorni consecutivi; la cui ultima somministrazione precede di 1h il challenge con l'antigene) prima del challenge con S1P.
Per la misurazione delle funzioni polmonari useremo la metodica precedentemente descritta nell'esperimento in vivo sui conigli. Le risposte funzionali saranno valutate, in ciascuno dei gruppi sperimentali sopra elencati, in tre giorni consecutivi secondo il seguente protocollo: il primo giorno, dopo aver misurato la funzione polmonare totale, i conigli verranno esposti ad aerosol di soluzione salina sterile per 2 minuti e saranno registrati i parametri polmonari. La responsività delle vie aeree sarà determinata esponendo gli animali a concentrazioni cumulative di aerosol di istamina (1,25-80 mg ml-1 ; 2 minuti per ciascuna concentrazione) dissolta in soluzione salina e somministrata direttamente nei polmoni mediante il tubo endotracheale. Dopo aver effettuato i 2 minuti di aerosol di istamina gli animali saranno disconnessi dal nebulizzatore e connessi al pneumotacografo di Fleisch (Mumed Ltd., London). I successivi 10 respiri saranno registrati e sarà calcolata la loro media. Il secondo giorno, dopo la misurazione dei parametri funzionali basali, i conigli saranno esposti a challenge con l'allergene o con soluzione fisiologica. Ogni challenge con l'allergene consisterà di 4 minuti di aerosol di soluzione salina seguiti da 5 aerosol consecutivi della durata di 4 minuti ciascuno (totale 20 minuti) di pjp (500 mg/ml). Le funzioni polmonari e la reattività bronchiale all'istamina verranno registrate come sopra descritto, 1h e 5h dopo il challenge con l'allergene o soluzione fisiologica. Il terzo giorno, dopo la misurazione dei parametri funzionali basali, la responsività bronchiale all'istamina sarà determinata come il primo giorno. L'aerosol di soluzione salina, di istamina e di allergene sarà generato da un nebulizzatore ad ultrasuoni (De Vilbiss Health Care, UK Ltd., Heston. Middlesex), capace di produrre particelle di un diametro compreso tra i 2 ed i 5 micron. Il lavaggio broncoalveolare (BAL), verrà effettuato immediatamente dopo l'aerosol di istamina nei giorni 1 e 3. Le vie aeree saranno lavate usando un catetere di polietilene inserito nei polmoni attraverso il tubo endotracheale; 5 ml di soluzione fisiologica 0.9% saranno iniettati nei polmoni e quindi immediatamente aspirati con un recupero maggiore del 50% del liquido inserito. La conta cellulare totale sarà effettuata mediante microscopia utilizzando l'emocitometro di Neubauer. Per la conta differenziale delle cellule aliquote di 25 ml saranno centrifugate (Centrifuga 2 Shandon; Shandon Southern Instruments, Sewickley, PA, U.S.A.) e le cellule saranno colorate con il colorante di Lendrum (ematossilina e cromotropo 2R) per facilitare il riconoscimento degli eosinofili. Un totale di 200 cellule saranno contate differenzialmente e classificate mediante i criteri morfologici standard come neutrofili, eosinofili o cellule mononucleate. La conta totale e differenziale delle cellule sarà espressa come numero di cellule per millilitro recuperato. Inoltre, verrà valutata la produzione di IL-4 e IL-5, nonché la produzione di IL-10 e di altre citochine mediante colorazione intracellulare e analisi di flusso delle cellule recuperate dal BAL. Campioni tissutali delle vie aeree saranno messi in azoto liquido e conservati a -80°C. In questo modo l'Unità di De Palma, attraverso RT-PCR, potrà determinare i messaggeri delle citochine e delle chemochine.