RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

EFFETTI NON EMOSTATICI DELLA TROMBINA: INTERAZIONE CON FATTORI DI CRESCITA, E SUO RUOLO NELLA PROLIFERAZIONE CELLULARE, IN PROCESSI NEURODEGENERATIVI E IN CONDIZONI DI ALTERATA PERMEABILITA' VASALE

Università di riferimento

Università Cattolica del Sacro Cuore - Medicina interna e geriatria - MILANO(MI)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Raffaele LANDOLFI

Descrizione

Il presente studio è mirato a verificare l'ipotesi che la trombina possa partecipare alla maturazione post-trascrizionale dei fattori di crescita, come FGF-2 e PDGF e modulare la loro attività a livello delle cellule bersaglio. Gli obiettivi specifici del presente studio saranno:
1) studio dugli effetti angiogenici e proliferativi della trombina su linee cellulari in coltura (cellule endoteliali [HUVEC] e cellule di melanoma) in presenza ed assenza sia dei fattori di crescita che della trombina stessa;
2) identificazione di nuovi substrati della trombina fra i fattori di crescita più comuni: FGF-2, PDGF-BB, NGF, per mezzo di tecniche di western-blot e HPLC;
3) studio sull'effetto proteolitico della trombina su FGF-2, PDGF-BB, PDGF-AA e NGF per determinare i parametri cinetici di stato-stazionario relativi alla loro idrolisi. I siti potenziali di clivaggio saranno ricercati, conoscendo la sequenza primaria dei fattori di crescita e le sequenze peptidiche potenzialmente disponibili per l'attività proteolitica della trombina.
4) Sintesi e valutazione funzionale di peptidi, che, sulla base dei risultati delle simulazioni di molecular modeling, possono inibire l'interazione trombina-FGF-2. Il legame di questi peptidi (oltre FGF-2, da cui i peptidi sono derivati) con la trombina sarebbe allora studiato tramite la tecnica della "surface plasmon resonance" (SPR).

Metodologie sperimentali
1) L'effetto della trombina (1-10 nM) e dei relativi TRAP (per il PAR-1 e PAR-4) sulla proliferazione cellulare sarà studiato in presenza o assenza di FGF-2, PDGF-BB e VEGF (tutti alle concentrazioni di 1-10 ng/ml). La linea di cellule endoteliali umane di vena ombelicale (HUVEC) e la linea metastatica umana di cellule di melanoma (SKMEL-110) saranno usate come modello sperimentale. Le cellule saranno coltivate a 37°C in aria con CO2 al 5% in medium EBM-2 (Clonetics) supplementato con medium di crescita endoteliale 2 (EGM-2) (Clonetics) o con DMEM (Gibco) supplementato con penicillina-streptomicina all'1% (Gibco), L-glutammina all' 1% (Gibco) e siero fetale di vitello trattato con carbone (Gibco) (SKMEL-110).
Studio della proliferazione cellulare
HUVEC o SKMEL-110 saranno coltivate in 6 piastre a pozzetti per 24 ore, poi non supplementare per una notte e stimolate entrambe con 10 ng/ml del fattore di crescita fibroblastico ricombinante umano 2 (FGF2) o trombina (0.1-10 nM), singolarmente o in miscela, per 24, 48 e 72 ore. Un inibitore specifico della trombina (PPACK) sarà usato per bloccarene irreversibilmente l'attività enzimatica. Saranno anche utilizzati altri fattori ricombinanti umani di crescita, come PDGF e/o VEGF. Dopo che le cellule verranno trattate con tripsina, colorate con soluzione di blu di trypan e contate in un emocitometro (camera di Neubauer modificata) in quadruplicato. Verrà studiata la cinetica di proliferazione cellulare per delucidare il ruolo specifico di ogni molecola e le relazioni funzionali con gli altri agenti nel processo biologico.
2) e 3) Identificazione di nuovi substrati della trombina tra i fattori di crescita più comuni: FGF-2, PDGF-BB, NGF, tramite tecniche HPLC e d elettroforetiche in western-blotting. La costante cinetica dell'associazione con la trombina dei potenziali substrati FGF-2, PDGF-BB e NGF sarà misurata utilizzando proteine ricombinanti selvatiche umane disponibili commercialmente. Le tecniche di western blotting useranno anticorpi policlonali e monoclonali specifici per ogni fattore (Santa Cruz). 400 ng di fattore di crescita da solo o di fattore di crescita preincubato con trombina attiva o inattiva (rapporto di 1:1) saranno sottoposti ad elettroforesi utilizzando SDS-PAGE (gel di 12% poliacrilammide) e trasferiti su membrana di nitrocellulosa. La comparsa di bande addizionali dopo trattamento con trombina sarà valutata tramite chemiluminescenza (ECL; Amersham) ed autoradiografia. Gli esperimenti effettuati in funzione del tempo permetteranno di misurare una costante di pseudo-primo ordine e quindi i valori di kcat/Km dell' idrolisi da parte della trombina dei suddetti fattori di crescita. Nel caso di un'idrolisi significativa, i peptidi generati saranno purificati con RP-HPLC (su colonna C4 o C18, dipendendo dalle caratteristiche molecolari) ed gli N-terminali saranno sequenziali per identificare i siti di idrolisi, come precedentemente riportato dal gruppo proponente (62).

4) Le sequenze peptidiche (10-30 residui) lungo la struttura primaria
di FGF-2 che, in base alle simulazioni molecolari studiate, saranno
previste partecipare al legame alla trombina, saranno comprate
da alcune aziende di prodotti chimici di sintesi (PepScan, Olanda; Primm, Milano) e/o sintetizzate in collaborazione con l'unità V partecipante a questo programma di ricerca (Dr. V. De Filippis, Università di Padova). I peptidi sintetizzati saranno usati in esperimenti di competizione per verificare la loro capacità di inibire l'idrolisi trombinica di FGF-2, come sopra sopra descritto. L'interazione diretta fra questi peptidi e trombina inoltre sarà studiata usando la tecnica di SPR. Lo strumento (Biacore X), le chips del sensore CM5, l'agente tensioattivo P20, il kit di accoppiamento aminico, contenente N-hydroxysuccinimide,
N-ethyl-N'-(3-diethylaminopropyl)carbodiimide ed il cloridrato
di etanolammina verrà acquistato da Amersham Bioscences. Gli esperimenti di SPR saranno effettuati su uno strumento di Biacore X dotato di circuito con chip a doppio flusso. L'immobilizzazione di FGF-2, PDGF-BB, e VEGF ricombinanti così come dei relativi peptidi di sintesi sarà effettuata su una cella di flusso, qui definita
"cella di flusso del campione," mentre la seconda cella di
flusso verrà utilizzata come cella di controllo. FGF-2
sarà immobilizzato sul circuito del sensore CM5 dopo attivazione della superficie di dextrano carbossimetilato da una miscela di 0.05 M di N-hydroxysuccinimide e 0.2 M di N-ethyl-N'-(3-diethylaminopropyl)carbodiimide, in accordo ad una procedura pubblicata (54). La reazione di accoppiamento sarà effettuata iniettando bFGF (80 µl, 1.25 µg/ml) diluito in tampone acetato 30 mM, pH 4.8. I
gruppi attivati residui saranno bloccati con il cloridrato di
etanolammina 1 M, pH 8.5. Il bFGF immobilizzato realizzerà circa 500 unità del segnale di risonanza (RU), corrispondenti approssimativamente ad una concentrazione di 0.5 ng/mm2. L'integrità del fattore di crescita immobilizzato è stata sarà esaminata iniettando un anticorpo anti-bFGF policlonale.
Tutti gli esperimenti saranno effettuati usando HBS (10 mM
Hepes, NaCl da 0.15 M, EDTA 3 mM, 0.005% di agente
tensioattivo P20, pH 7.4) come tampone di corsa e diluente dei
fattori iniettati. Sarà usta una velocità di flusso di circa 30 µl/min. I ligandi solubili, vale a dire trombina attiva ed inibita, saranno iniettati per una fase di associazione di circa 30 sec, seguita da un flusso di HBS per una fase di dissociazione di 2 min. La risposta espressa come sensorgramma, in RU versus tempo, sarà controllata a 25 °C. L'indice di rifrazione di base ed il legame non specifico verranno sempre sottratti. La rigenerazione
del circuito del sensore sarà realizzata iniettando 10 µl di 50 mM di NaOH dopo ogni iniezione. Tutte le iniezioni saranno eseguite in triplicato.

Conclusioni ed Obiettivi

I risultati che lo studio presente potrebbe ottenere possono offrire
nuove chiavi di comprensione degli effetti angiogenici della
trombina in vivo. Osservazioni cliniche molto comuni indicano che
la trombina è coinvolta in funzioni cellulari quali l'angiogenesi e la proliferazione. Per esempio, si osserva comunemente che dopo trombosi di una grande vena, l'embolo si ricanalizza con nuovi vasi evidenziabili angiograficamente. Inoltre è riconosciuto che mentre la trombina nel plasma è inattivata velocemente dall'antitrombina, le molecole dell'enzima bloccate all'interno dei trombi sono protette e lentamente vengono rilasciate durante la trombolisi. Questa trombina bloccata fungerebbe da fattore di controllo angiogenetico di concerto con i fattori di crescita, tramite la chemiotassi di cellule endoteliali, mediando il loro fenotipo angiogenico. Inoltre, è riconosciuto il fatto che la trombina interagisce con vari costituenti della matrice endoteliale (ECM). La trombina immobilizzata su ECM è protetta dall'inattivazione dei
suoi inibitori circolanti ed induce molte risposte cellulari.
Il legame della trombina all'ECM subendoteliale, mediante un corto sito di ancoraggio, lascia la maggior parte della
molecola funzionale e disponibile per interazioni cellulari. In conclusione, l'indagine sui meccanismi molecolari e cellulari
collegati all'attività trombinica, proposta nel presente studio può
contribuire a delucidare i seguenti punti:

1) il ruolo potenziale della trombina nel processamento idrolitico
post-trascrizionale dei fattori di crescita. In particolare, lo studio cinetico di queste interazioni catalitiche si occuperà dell'interazione trombina-FGF2. Il chiarimento della cinetica di questa interazione può aiutare a comprenderne l'eventuale ruolo fisiologico nell'angiogenesi;

2)le condizioni sperimentali in cui la trombina, di concerto con l'azione di fattori di crescita, esercita una funzione pro- o anti-angiogenica sulle cellule endoteliali normali o in una
linea cellulare neoplastica di melanoma in coltura;

3) i risultati possono fornire una base e una spiegazione razionale
per gli effetti non canonici della terapia antitrombinica (63-64). Ciò
apre la possibilità di sviluppare agenti che interferiscono con
l'azione angiogenica della trombina senza effetti sulla coagulazione del sangue. Tali agenti sarebbero più facili da usare dell'eparina e di altri anticoagulanti nella pratica clinica e soprattutto sarebbero più specifici per i risultati desiderati.