RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

EFFETTI NON EMOSTATICI DELLA TROMBINA: INTERAZIONE CON FATTORI DI CRESCITA, E SUO RUOLO NELLA PROLIFERAZIONE CELLULARE, IN PROCESSI NEURODEGENERATIVI E IN CONDIZONI DI ALTERATA PERMEABILITA' VASALE

Università di riferimento

Università degli Studi di BARI - FARMACO CHIMICO - BARI(BA)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Cosimo Damiano ALTOMARE

Descrizione

OBIETTIVI
Il programma di ricerca dell'Unità locale dell'Università di Bari si rivolgerà all'investigazione, mediante metodologie computazionali avanzate, sulle basi molecolari dell'allosterismo della trombina e le sue conseguenze sia sull'attività catalitica che sulle interazioni della trombina con fattori proteici responsabili degli effetti non emostatici, specialmente quelli dovuti all'interferenza con l'attività del fattore di crescita fibroblastico 2 (FGF-2). Il programma di ricerca prevede anche la sintesi e la valutazione biochimica e farmacologica di nuovi peptidi e peptidomimetici potenzialmente attivi come modulatori della trombina e di fattori della coagulazione strutturalmente ad essa correlati (es. fXa), con l'obiettivo finale di progredire nelle conoscenza delle basi molecolari dell'attività della trombina. Per il raggiungimento di questi scopi, la ricerca si avvarrà delle informazioni strutturali disponibili (es. cristallografia a raggi X, spettroscopia NMR, modelling molecolare) relativamente alle proteine target. Nell'investigazione sull'interazione della proteasi a serina trombina, e di fattori della coagulazione ad essa strutturalmente correlati, è emersa la necessità di integrare le informazioni strutturali ricavate dalla cristallografia a raggi X con procedure computazionali di recente sviluppo nel drug design, basate sull'applicazione di metodi di analisi statistica multivariata [1, 2] alla mappatura di regioni enzimatiche effettivamente responsabili di riconoscimento molecolare selettivo, e di calcoli di docking flessibile alla generazione di attendibili ipotesi di modi di binding dei ligandi. Questi approcci sono stati applicati, con risultati soddisfacenti, dall'unità di ricerca richiedente alla progettazione di inibitori di altri target enzimatici di rilevanza medicinale, quali gli isoenzimi monoammino ossidasi (MAO) [3, 4], mentre più recentemente l'unità richiedente ha applicato metodi di calcolo della dinamica molecolare (MD) al fine di razionalizzare la perdita, dipendente dal peculiare folding proteico, di attività catalitica da parte di un mutante patologico della trombina (identificata come DesK9, ad indicare la mutazione per delezione del residuo Lys-9 nella catena leggera) rispetto a forme "wild-type" della trombina [5]. Nell'insieme, i risultati computazionali da noi ottenuti hanno costituito un valido supporto all'osservazione sperimentale, indicando che la delezione del residuo Lys-9 nella catena leggera (catena A) può indurre variazioni conformazionali nel sito attivo, attraverso effetti allosterici a lunga distanza. Un obiettivo derivato, ma ugualmente importante, può essere costituito dall'identificazione di possibili nuovi peptidomimetici agenti come modulatori della trombina, soprattutto inibitori, da sviluppare come nuovi agenti utili nella profilassi e nella terapia di malattie trombotiche.

In sintesi, il progetto è volto al conseguimento dei seguenti obiettivi interconnessi tra loro: (1) progresso nelle conoscenze dei meccanismi molecolari alla base dell'allosterismo della trombina e della sua influenza sull'interazione con fattori proteici responsabili di effetti non emostatici; (2) progresso nelle conoscenze sulle basi molecolari delle patologie trombotiche, che rappresentano cause principali di morte nei paesi industrializzati; (3) affinamento dei modelli di relazione struttura-funzione della trombina e fattori strutturalmente correlati; (4) identificazione di peptidomimetici in grado di modulare selettivamente la trombina, da sviluppare possibilmente come agenti utili nella terapia e nella profilassi.

PROGRAMMA DI RICERCA
Il programma di ricerca si articolerà nelle seguenti tre fasi:

(1) INDAGINE SULLE BASI MOLECOLARI DELL'ALLOSTERISMO DELLA TROMBINA. Durata prevista: 8 mesi
Saranno esaminate le coordinate delle strutture 3D di trombine libere e legate, disponibili nella Banca Dati delle Proteine (PDB) e/o costruite mediante tecniche di costruzione per omologia. Il programma prevede un'indagine approfondita sulle proprietà conformazionali (folding) delle proteine target, ma anche di alcuni mutanti identificati in pazienti affetti da gravi difetti della coagulazione, mediante simulazioni MD e calcolo delle proprietà (campi di interazione molecolari, MIF). In particolare, costituiranno l'oggetto principale della nostra indagine computazionale il mutante risultante dalla delezione del residuo Lys-9 in catena A (DesK9), per il quale l'unità di ricerca locale ha recentemente dimostrato, attraverso una lunga simulazione MD in solvente acquoso esplicito, il verificarsi di perturbazioni conformazionali che si propagano dal sito di delezione, attraverso una sorta di "effetto-domino", al sito di specificità S2 ed ai residui del sito attivo [5]. Insieme al mutante DesK9, saranno studiate, per le loro proprietà dipendenti dal folding, altre varianti trombiniche, come ad esmpio R67H, avente una limitata interazione con tutti i leganti dell'esosito I di binding anionico della trombina [6]. Sarà effettuato un esame comparativo tra i comportamenti dinamici delle menzionate proteine e trombine cristallizzate sia nella forma "slow" (anticoagulante) che nella forma "fast" (procoagulante), al fine di progredire nella identificazione delle interazioni inter- e intramolecolari responsabili dell'allosterismo della trombina. I modelli molecolari proteici saranno esaminati, lungo le intere traiettorie MD, con l'ausilio di metodologie avanzate per il modelling e il calcolo delle proprietà chimico-fisiche. In particolare, saranno esaminate la dipendenza dal pH dell'attività catalitica e differenze/similarità nelle forme dei siti di legame responsabili degli effetti trombinici, calcolando rispettivamente i valori teorici di pKa dei residui catalitici [7] e stimando superfici, cavità e interazioni intermolecolari [8], tutte dipendenti dal folding. Da questa fase del programma di ricerca ci si attende di ricavare informazioni su aspetti rilevanti dell'allosterismo trombinico che determina la specificità verso agenti modulatori. Un secondo obiettivo di questa fase della ricerca è costituito dal miglioramento delle capacità predittive di strategie e tecniche di modelling molecolare applicati a studi sulla trombina.

(2) INDAGINE MEDIANTE METODI COMPUTAZIONALI DI DOCKING PROTEINA-PROTEINA SULLE INTERAZIONI TRA TROMBINA E FATTORI PROTEICI. Durata prevista: 8 mesi
In questa fase del programma, con l'ausilio di metodi computazionali di docking molecolare, dimostratisi attendibili nella predizione di interazioni proteina-proteina in molti casi [9], saranno studiate alcune rilevanti interazioni tra trombina e fattori proteici. Come illustrato nel background di questo progetto, il trombo contiene svariate molecole, come i fattori di crescita PFGF (di derivazione piastrinica), VEGF (fattore di crescita vascolare endoleliale), FGF-2 (fattore di crescita fibroblastico 2), serotonina, trombossano e trombina attiva che possono essere rilasciate nel lume vasale facilitando vasocostrizione e proliferazione tessutale in un'area con danno endoteliale.. Inoltre, un certo numero di evidenze sperimentali hanno portato a concludere che l'azione angiogenica della trombina è recettore-mediata e indipendente dalla formazione di fibrina. Specificamente, in questa fase della ricerca saranno indagate le basi molecolari dell'interazione tra trombina e FGF-2. L'esistenza di questa interazione è stata recentemente dimostrata da R. De Cristofaro e coll., componenti di un'unità di ricerca nel presente PRIN (Facoltà di Medicina dell'Università Cattolica, Roma), i cui risultati preliminari [comunicazione personale] indicano che l'FGF-2, subito il clivaggio da parte della trombina, non solo perde la sua capacità di stimolare la crescita cellulare, ma genera anche sequenze peptidiche che, attraverso un meccanismo a feedback negativo, induce apoptosi. Infatti, prove sperimentali chiaramente dimostrano che la trombina inibisce l'effetto dell'FGF-2 su culture di HUVEC.
L'investigazione sulle interazioni tra trombina ed FGF-2, pianificata allo scopo di poter generare orientazioni corrette di docking con ragionevole probabilità e di identificare sequenze peptidiche responsabili del riconoscimento molecolare, sarà effettuata utilizzando protocolli computazionali e algoritmi dimostratisi affidabili nel predire interazioni proteina-proteina. Utilizzando le coordinate dei due componenti proteici, sarà dapprima effettuata una ricerca di tipo "rigid-body" di complessi e generato un insieme di possibili complessi. Questi ultimi saranno riclassificati, in base all'energia di associazione, ed in un successivo stadio verrà introdotto nel calcolo un fattore di flessibilità, almeno nelle catene laterali e possibilmente anche nello scheletro proteico. L'affinamento delle strutture dei complessi e la riclassificazione forniranno, quindi, una lista finale di modelli di interazione proteina-proteina, che dovrebbe consentire la formulazione di ipotetici modi di binding (e i relativi esositi trombinici) e di individuare regioni molecolari del fattore proteico (sequenza/e peptidica/che) coinvolte probabilmente nell'interazione e/o responsabile del riconoscimento molecolare. In approcci computazionali integrati, sarà utilizzato un ampio spettro di metodi computazionali, che hanno dimostrato di conseguire elevati livelli di accuratezza, risoluzione ed efficienza nella identificazione e caratterizzazione strutturale di complessi macromolecolari [10, 11].

(3) PROGETTAZIONE, SINTESI E VALUTAZIONE BIOLOGICA DI PEPTIDI E PEPTITOMIMETICI POTENZIALMENTE ATTIVI COME MODULATORI DELLA TROMBINA. Durata prevista: 8 mesi
La convalida delle ipotesi generate per via computazionale nella seconda fase del programma verrà effettuata sintetizzando e saggiando oligopeptidi e/o peptidomimetici che riproducano o mimino la sequenza individuata come responsabile del riconoscimento da parte della trombine. I peptidomimetici saranno progettati e chimicamente elaborati su scaffold molecolari aventi stereochimica e proprietà chimico-fisiche appropriate. La selezione dei raggruppamenti chimici sarà effettuata nello spazio dei "building blocks", avvalendosi di metodi di disegno molecolare statistico, dati di letteratura e test biochimici preliminari su analoghi non rigidi facili da sintetizzare. La sintesi delle molecole progettate verrà condotta utilizzando i metodi classici di sintesi in soluzione; saranno, inoltre, esplorate le condizioni per la messa a punto di metodi di sintesi in fase solida da utilizzare, in una fase successiva della ricerca, nella preparazione di specifiche chemoteche ("combinatorial libraries").
Le molecole di nuova sintesi saranno saggiate per la loro capacità di interferire e modulare gli effetti della trombina WT (e dei suoi mutanti patologici). Saranno investigati i loro effetti sull'attività catalitica della trombina e l'interazione funzionale tra FGF-2 e trombina su colture di cellule endoteliali umane da cordone ombelicale (HUVEC). E' in programma anche lo screening dell'interferenza sull'interazione della trombina con i recettori di membrana PAR, GpIb-V e trombomodulina (TM). Uno studio delle relazioni struttura-attività, condotto con l'ausilio di metodi di analisi statistica multivariata, completerà questa fase del progetto.
Lo screening biologico delle molecole di nuova sintesi sarà effettuato in collaborazione con l'unità della Facoltà di Medicina dell'Università Cattolica (Roma). Da questo stadio della ricerca ci si attende di progredire nella comprensione dei meccanismi molecolare alla base degli effetti emostatici e non emostatici della trombine e, possibilmente, di identificare nuovi modulatori trombinici dotati di potenziale terapeutico.

Collaborazioni possibili con altre unità operative del progetto:
Rapporti di stretta collaborazione con l'unità di ricerca della Facoltà di Medicina dell'Università Cattolica del Sacro Cuore (Roma) consentiranno di conseguire gli obiettivi progettuali, assicurando la convalida, mediante test biologici, di ipotesi elaborate alla luce dei risultati computazionali, e la valutazione dell'attività di molecole (oligopeptidi e/o peptidomimetici) ideati tenendo conto dei risultati del modelling molecolare. Sarà stabilita una collaborazione con il Dott. V. De Filippis (Unità di Ricerca dell'Università di Padova) negli studi di modelling molecolare e nella sintesi peptidica in fase solida. Sarà favorita la cooperazione con le altre due unità del consorzio scientifico costituito per questo PRIN al fine di esaminare approfonditamente tutte le implicazioni nel controllo delle azioni della trombine dei modelli computazionali e dei dati biologici ottenuti.

Riferimenti bibliografici
[1] Linusson, A.; Gottfries, J.; Olsson, T.; Ornskov, E.; Folestad, S.; Norden, B.; Wold, S. Statistical molecular design, parallel synthesis, and biological evaluation of a libray of thrombin inhibitors. J. Med. Chem. 2001, 44, 3424-3439
[2] Kastenholz, M.A.; Pastor, M.; Cruciani, G.; Haaksma, E.E.J.; Fox, T. GRID/PCA: a new computational tool to design selective ligands. J. Med. Chem. 2000, 43, 3033-3044
[3] Gnerre, C.; Catto, M.; Leonetti, F.; Weber, P.; Carrupt, P.-A.; Altomare, C.; Carotti, A.; Testa, B. Inhibition of monoamine oxidases by functionalyzed coumarin derivatives: Biological activities, QSARs, and 3D-QSARs. J. Med. Chem. 2000, 43, 4747-4758
[4] Carrieri, A.; Carotti, A.; Barreca, M.L.; Altomare, C. Binding models of reversible onhibitors to type-B monoamine oxidase. J. Comp.-Aided Mol. Des. 2002, 16, 769-778
[5] De Cristofaro, R.; Akhavan, S.; Altomare, C.; Carotti, A.; Peyvandi, F.; Mannucci, P. M. A natural prothrombin mutant reveals an unexpected influence of A-chain structure on the activity of human alpha-thrombin. J. Biol. Chem. 2004, 279, 13035-13043
[6] Akhavan, S.; De Cristofaro, R.; Peyvandi, F.; Lavoretano, S.; Landolfi, R.; Mannucci, P.M. Molecular and Functional Characterization of a Natural Homozygous Arg67His Mutation in the Prothrombin Gene of a Patient with a severe contrasting with a mild Hemorrhagic Phenotype. Blood 2002, 100, 1347-1353
[7] Nielsen, J. E.; Vriend, G. Optimizing the hydrogen-bond network in Poisson-Boltzmann equation-based pKa calculations. Proteins 2001, 43, 403-412
[8] Laskowski, R.A. SURFNET: A program for visualizing molecular surfaces, cavities and intermolecular interactions. J. Mol. Graph. 1995, 13, 323-330
[9] Smith, G.R.; Sternberg, M.J.E. Prediction of protein-protein interactions. Curr. Opin. Struct. Biol. 2002, 12, 28-35
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