RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

EFFETTI NON EMOSTATICI DELLA TROMBINA: INTERAZIONE CON FATTORI DI CRESCITA, E SUO RUOLO NELLA PROLIFERAZIONE CELLULARE, IN PROCESSI NEURODEGENERATIVI E IN CONDIZONI DI ALTERATA PERMEABILITA' VASALE

Università di riferimento

Università Cattolica del Sacro Cuore - Medicina interna e geriatria - MILANO(MI)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Giovanni GAMBASSI

Descrizione

Saranno inclusi nello studio 200 soggetti volontari, di entrambi i sessi, di età compresa fra i 50 e 80 anni, con una scolarità minima di 5 anni, afferenti alla Clinica della Memoria del Centro Medicina dell'Invecchiamento presso il Policlinico Agostino Gemelli. Il progetto prevede una fase di screening allo scopo di valutare la presenza dei criteri per la diagnosi di minimal cognitive impairment (MCI) o demenza, una fase sperimentale, ed una di follow-up

1. FASE di SCREENING
1.1 Batteria neuropsicologica. Tale batteria è volta a studiare i deficit di memoria richiesti per la diagnosi di MCI e di demenza primaria. Essa prevede: Valutazione cognitiva generale, della Memoria Episodica e della Memoria a Breve Termine, delle Funzioni Frontali, del Linguaggio, del Problem Solving; dell'Attenzione e della Prassia Costruttiva.
1.2 Test aggiuntivi. Test volti a studiare le capacità funzionali nella esecuzione delle attività della vita quotidiana, sia quelle fondamentali (ADL) che quelle strumentali (IADL). Inoltre, verranno escluse di patologie psichiatriche maggiori.
1.3. Diagnosi di MCI e demenza. La diagnosi di MCI verrà posta in presenza di a) disturbi soggettivi di memoria, b) rendimento patologico per età e scolarità in prove di memoria, c) tale disturbo non deve interferire sulle attività della vita lavorativa, sociale e quotidiana del soggetto, d) assenza di demenza, ed e) assenza di altre condizioni morbose che possano spiegare il disturbo di memoria. Per la diagnosi di malattia di Alzheimer si utilizzeranno i criteri NINCDS-ADRA di malattia probabile o possibile. La stadiazione sarà fatta attraverso la Clinical Dementia Rating Scale.
1.4 Batteria clinica generale. Tale batteria è volta ad escludere qualsiasi patologia internistica, metabolica, endocrina o neurologica potenzialmente responsabile dei deficit di memoria. Essa prevede: esami ematochimici (emocromo completo, VES, elettroliti sierici, azotemia, glicemia, creatinemia, uricemia, bilirubinemia, SGOT, SGPT, γ-GT, elettroforesi proteica, valutazione della funzionalità tiroidea, dosaggio vitamina B12 e folati, sierologia per la sifilide, analisi delle urine, Rx torace, elettrocardiogramma, esame obiettivo neurologico, TC o RM encefalo.
1.5 Criteri di inclusione. Alla fine della fase di screening verranno ritenuti validi per l'inclusione nel progetto di ricerca i soggetti che avranno riportato alla batteria neuropsicologia: a) un punteggio (corretto per età e scolarità) MMSE ≥18, b) un punteggio CDR 0.5, c) almeno un punteggio su 3 patologico nelle prove di memoria episodica.
1.6 Criteri di esclusione. Verranno esclusi i pazienti con: a) neoplasie attive od in trattamento; b) recente (≤6 mesi) intervento chirurgico; c) recente (meno di 3 mesi) TIA/ictus o con esiti invalidanti; d) diabete scompensato; e) BPCO con insufficienza respiratoria cronica; f) malattia ematologica od emocoagulativa accertata; g) infezione con virus HBV, HCV, HIV; h) insufficienza renale severa (creatininemia >3 mg/dl); i) crolli vertebrali osteoporotici; l) anemia moderata-severa (Hb <9 g/dl); m) endocrinopatie non compensate; n) cirrosi epatica (Child B o C); o) morbo di Parkinson in fase III-IV Hohen-Yahr; p) scompenso cardiaco classe IV NYHA; q) arteriopatia periferica stadio IV; r) ricovero ospedaliero nei tre mesi precedenti per qualsiasi ragione; s) grave deficit sensoriale.
1. 7 Soggetti di controllo. Oltre ai pazienti con MCI o con diagnosi di Malattia di Alzheimer verranno selezionati un numero congruo di soggetti di controllo di età e sesso paragonabili, senza altra patologia clinica rilevante.

2. FASE DI STUDIO SPERIMENTALE
2.1 PROTOCOLLO NEUROPSICOLOGICO. In tutti i soggetti reclutati nella fase di screening, la valutazione neuropsicologica sarà completata dalla valutazione dei seguenti parametri di memoria: a) l'oblio dell'informazione dalla memoria a lungo termine; b) la codifica semantica nell'apprendimento episodico; c) l'efficienza del priming di ripetizione. Verranno inoltre effettuate una valutazione dei disturbi soggettivi di memoria mediante la Memory Assessment Clinics-Questionnaire (MAC-Q), ed una valutazione dei disturbi del comportamento mediante Intervista sul Comportamento Spontaneo (I.C.S.)
2.2 PROTOCOLLO BIOCHIMICO. Verranno raccolti campioni di sangue, urine e liquido cefalo-rachidiano; in seguito verranno estratte preparazioni piastriniche. Verrà accertata la presenza di trattamento con FANS, anticoagulanti orali, farmaci serotoninergici, o cortico-steroidi, trattamento estro-progestinico, o con farmaci anticolinesterasici.
2.2.1 Raccolta e preparazione dei campioni
Campioni di sangue (27 ml) verranno prelevati in provette contenenti 3 ml di sodio citrato e glucosio. Il sangue sarà diviso in 3 provette da 10cc, centrifugato a 1000 rpm x g per 15 min per trasferire il sovranatante. Verrà poi centrifugato il PRP a 3000 rpm per 25 min, lavato con tampone il pellet di piastrine e conservato a -80°C. Il sangue intero potrà essere ricostituito per l'isolamento dei linfociti e estrazione del DNA genomico. Prelievi di CSF verranno conservati in aliquote in tubi di polipropilene a -80°C. Per una migliore conservazione nel tempo i campioni di CSF verranno suddivisi in aliquote e congelati in presenza di un cocktail di inibitori di proteasi (Complete, Boehringer).
2.2.2 Western Blot e immunostaining
Le piastrine verranno sospese in tampone e le proteine totali presenti in omogenato valutate secondo Bradford. 5 mg di proteine per ciascun campione verranno separate in SDS-PAGE elettroforesi (policrilamide 6%) e trasferite su nitrocellulosa. Le isoforme di APP verranno riconosciute mediante incubazione con anticorpo monoclonale 22C11. All' interno dello stesso campione verrà valutata la immunoreattività per actina, per valutare possibili degradazioni delle strutture proteiche. I complessi antigene-anticorpo verranno rivelati mediante chemiluminescenza (ECL, Amersham). L'analisi quantitative dei Western blot verrà effettuata mediante analisi computerizzata dell'immagine. La stessa metodica di immunostaining verrà utilizzata per la valutazione di tau e di sAPP in CSF con anticorpi specifici.
2.2.3 Prelievo di sangue in EDTA e isolamento di DNA
I campioni di sangue si pongono come fonte principale per l'estrazione di DNA e RNA. L'estrazione di DNA e RNA verrà effettuata da sangue periferico con KIT di laboratorio. Verranno quindi eseguite:
2.2.3.1 Analisi mutazionale nei geni delle preseniline
L'analisi di variazioni nucleotidiche nei geni delle preseniline verrà effettuata direttamente su DNA genomico o su prodotti di RT-PCR (cDNA derivante da RNA estratto) mediante i sequenziatori automatici ABI310 e ABI3100 Avant utilizzando marcatori fluorescenti.
2.2.3.2. Analisi mutazionale del gene APP
L'analisi di variazioni nucleotidiche nel gene APP verrà effettuata direttamente su DNA genomico (precisamente a livello degli esoni 16 e 17 ove sono state identificate mutazioni) sempre mediante i sequenziatori automatici.
2.2.4 Markers coagulativi
Oltre ai test standard (tempo di protrombina, tempo di tromboplastina parziale, fibrinogeno, tempo di emorragia) verranno dosati anticorpi anticardiolipina, lupus anticoagulant, omocisteina, D-Dimeri. Inoltre sarà testata: a) la Resistenza Proteina C attivata e la ricerca in biologia molecolare del Fattore V Leiden (in caso di positività del test precedente); b) Ricerca mutazione G20210A della protrombina; c) Fattore di von Willebrand, dosato come antigene e come "Collagen binding activity"; d) Studio dell'aggregazione piastrinica classica e sotto flusso (PFA-100, Dade-Behring); e) Mutazione C677T della MTHFR (effettuabile solo nel caso che l'omocisteinemia sia > 15µM).
2.2.5 Dosaggio dei prodotti di attivazione protrombinica e di attività trombinica
Il frammento F1.2 della protrombina, il prodotto di attivazione della protrombina, il complesso (TAT) trombina-antitrombina verranno misurati con la tecnica sandwich ELISA (Enzygnost F1+2 micro, and Enzygnost TAT, Behringwerke, Marburg, Germany), usando una lettore di piastre spettrofotometrico tipo Benchmark II (Bio-Rad). Queste determinazioni saranno effettuata sia sul plasma che sulle urine ed in selezionati pazienti anche sul liquido cefalo-rachidiano.
2.2.6 Markers amiloide-correlati
2.2.6.1 Proteina beta-amiloide
La proteina beta-amiloide è presente in due forme principali che contengono o 40 (Abeta-40) o 42 (Abeta-42) aminoacidi a seconda della terminazione C. Lo sviluppo di metodica ELISA ultrasensibili sia per Abeta-40 che per Abeta-42 consente la scoperta e la misurazione quantitativa nel sangue. Inoltre, misureremo la presenza di autoanticorpi sia nel plasma che nel CSF.
2.2.6.2 Isoforme della proteina precursore dell'amiloide nelle piastrine
Nelle piastrine la proteina precursore della amiloide intatta (150 kDa) è processata in forme di 120–130 kDa e di 110 kDa carbossi-troncate; tutte queste possono essere individuate con Western blot utilizzando anticorpi 22C11. Il rapporto tra forme troncate di alto (120–130 kDa) e di basso peso molecolare ("APP isoform ratio") sarà quindi misurato. Verranno investigate la concentrazione di BACE e BACE Delta 7 (enzimi della via amiloidogenica dell'APP), di ADAM 10 (enzimi della via non amiloidogenica dell'APP) e di proteine di internalizzazione contenenti domini PTB e/o PDZ (in grado di regolare la formazione di complessi di interazione proteina-proteina con APP) in piastrine.
2.2.7 Proteina tau
Studio del pattern delle isoforme liquorali della proteina tau e del loro grado di fosforilazione con analisi di screening 2DE e rilevazione in chemiluminescenza dopo immunoblotting.
2.2.8 APOE
L'allele APOE ε4 è associato ad un deposito maggiore di amiloide all'interno delle placche, e ad una maggiore concentrazione di Aβ40 nel cervello di pazienti con Malattia di Alzheimer. Il fenotipo APOE sarà misurato dal plasma con isoelectric focusing oppure mediante ELISA. APOE sarà anche determinato su campioni di liquido cefalo-rachidiano.
2.2.9 Markers of inflammation
La deposizione di amiloide nel cervello innesca una serie di reazioni infiammatorie. In questo progetto verranno misurate alcune marcatori infiammatori incluso: la proteina C-reattiva, interleuchina (IL)-beta, tumor necrosis factor-α, IL-6, IL-6 receptor complex, IL-10. I livelli di IL-6, IL-6sR e il TNF-α saranno quantificati mediante immunoassay con kit commerciali (BioSource Cytoscreen UltraSensitive kits). I livelli serici di IL-1RA saranno quantificati con metodo ELISA con kit commerciali (EASIATM ELISA Human IL-1RA, BioSource International Inc., Camarillo, CA, USA). I livelli serici di IL-10 saranno determinati con il IL-10 CytoSETS TM ELISA kits (BioSource International Inc., Camarillo, CA, USA).
2.3 PROTOCOLLO NEUROIMAGING.
2.3.1 Tomografia computerizzata/Risonanza Magnetica Nucleare
Verrà eseguita studio mediante: Scout view secondo il piano sagittale, Studio standard dell'encefalo (es. sezioni assiali di 4 e 8, o di 5 e 7, o di 5 e 10 mm rispettivamente su fossa cranica posteriore e compartimento sovratentoriale) utilizzando il piano orbito-meatale, Studio della regione temporale condotto con inclinazione rigorosamente di -20° rispetto al piano orbito-meatale con sezioni assiali di 2 mm di spessore senza gap (in alternativa sezioni di 3 mm di spessore con avanzamento di 2 mm) condotte nel segmento compreso fra il pavimento della fossa cranica media ed il limite inferiore dell'orbita. Le immagini dell'encefalo standard saranno fotografate seguendo un formato di film normale (es. 20 immagini per foglio). Lo studio della regione temporale sarà fotografato con un formato inferiore a 10 immagini per foglio, per facilitare la fase successiva delle misurazioni. Le misurazioni verranno effettuate centralmente su lastra valutando: ampiezza assiale del corno temporale, volumetria dei lobi cerebrali e delle strutture temporali-mesiali, spessore minimo del lobo temporale mediale, ampiezza radiale del corno temporale, distanza interuncale, voxel-based morphometry della sostanza bianca e la iperintensità della sostanza bianca. I valori ottenuti saranno normalizzati rispetto alla popolazione di controllo.
2.3.2 PET
I pazienti saranno esaminati con tecnica PET dopo aver osservato un digiuno di almeno 6 ore. L'esame PET verrà effettuato utilizzando un apparecchio Siemens ECAT HR+ (axial field of view 155mm), capace di 63 sezioni contigue di 2.46mm con una risoluzione transassiale di 5.6mm ed assiale di 5.4mm. I dati verrano acquisiti in modo tridimensionale. Ai pazienti verrà praticata una infusione di circa 300MBq di un tracciante radioattivo dell'amiloide (PIB, Sigma-Aldrich). L'esame PET misurerà l'uptake del tracciante secondo un serie predeterminata di misurazioni (frames 2 × 60, 3 × 120, 4 × 180, 4 × 300, e 2 × 600 secondi) per 60 minuti. Inoltre ai pazienti verrà praticata una infusione endovenosa di 200 to 300MBq di 18FDG misurando la radioattività nel cervello per 5 × 60, 5 × 180, 5 × 300, and 1 × 600 secondi per 55 minutes. La concentrazione plasmatici di glucosio sarà misurata tre volte, una prima e due dopo l'iniezione di 18FDG. Le immagini saranno ricostruite con standard software (ECAT 7.1; CTI PET Systems, Knoxville, TN), usando un Fourier rebinning con two-dimensional filtered back-projection con l'applicazione di un filtro Hanning (4 mm). Una procedura di riorientamento computerizzato sarà utilizzata per riallineare diversi studi PET e consentire comparazioni intra- ed interindividuali. Tutti gli esami PET saranno analizzati focalizzandosi sulle identiche regioni di interesse (ROI). Le ROI corticali (1x3 cm) saranno posizionate sulla corteccia frontale e su quella parietale. ROI per lo striato saranno posizionate a livello della captazione maggiore. Altre ROI corticali saranno posizionate nella corteccia occipitale e cerebellare a livello delle zone di maggiore uptake radioattivo e nella corteccia temporale. I dati saranno espressi in termi di valori di uptake standardizzato (SUV). SUV saranno ottenuti normalizzando la concentrazione tissutale (nCi/ml) per la dose (nCi) e la massa corporea (in unita di ml, con l'approssimazione che 1gm sia uguale a 1ml). Mappe parametriche del metabolismo del glucosio (rCMRglc) saranno generate con la tecnica Patlak. Considerato la emivita di 20 minuti del carbonio 11, 18FDG scan potranno essere eseguiti dopo circa 120 minuti dopo la iniezione di PIB.
2.4 PROTOCOLLO FARMACOLOGICO.
Sarà valutata la possibilità di sottoporre selezionati pazienti a trattamento farmacologico con 3 gruppi di farmaci capaci di contrastare il possibile ruolo patogenetico della trombina nella malattia neurodegenerativa. Questi sono, gli inibitori della trombina, e la eparina a basso peso molecolare. E' prevista la possibilità di utilizzare lo ximelagatran, un inibitore specifico della trombina con dimostrate possibilità di attraversare la barriera emato-encefalica. La sua somministrazione per os, la non necessità di eseguire test emocoagulativi di controllo, la sua relativa sicurezza ne fanno un candidato ideale. Un gruppo di pazienti, potrà ricevere enoxaparina al dosaggio di 100 UI/kg peso corporeo in quanto l'enoxaparina in modelli animali si è dimostrata capace di ridurre la concentrazione ed i depositi di beta-amiloide seppur non se ne conoscano i meccanismi effettori.
3. FASE DI FOLLOW-UP - Dopo la valutazione sperimentale, a tutti i soggetti verrà riproposta la batteria neuropsicologica di screening ogni 12 mesi per un periodo complessivo di 2 anni. Inoltre, i soggetti in trattamento verranno rivalutati anche con le metodiche di neuroimaging.